低级别浆液性卵巢癌腹腔内化疗中癌信号通路与免疫微环境的动态演变研究

《npj Precision Oncology》：Divergent oncogenic signaling and immune microenvironment changes in low-grade serous ovarian cancer patients undergoing intraperitoneal chemotherapy

本研究针对低级别浆液性卵巢癌(LGSOC)治疗耐药难题，通过单细胞核RNA测序技术追踪PIPAC治疗过程中肿瘤分子特征与免疫微环境的动态变化。研究发现应答者与非应答者分别呈现截然不同的癌信号通路激活模式(如MYC、E2F、PI3K等)和免疫抑制细胞(Tregs、巨噬细胞)浸润特征，揭示了肿瘤适应性耐药机制，为开发多靶点联合治疗策略提供了关键理论依据。

　　

在卵巢癌的众多亚型中，低级别浆液性卵巢癌（Low-Grade Serous Ovarian Carcinoma, LGSOC）以其独特的生物学行为和临床挑战性而备受关注。尽管其生长相对缓慢，但LGSOC对传统的铂类化疗药物表现出显著的耐药性，导致约70%的晚期患者面临疾病复发的困境。与更为常见的高级别浆液性卵巢癌（High-Grade Serous Ovarian Carcinoma, HGSOC）相比，LGSOC患者通常更年轻，且一旦复发，对系统性化疗的反应率极低，不足5%。其分子特征常涉及MAPK/RAS和PI3K-AKT信号通路的异常激活，这被认为是其治疗抵抗和疾病进展的核心驱动力。对于复发患者，尤其是出现广泛、无法手术切除的腹膜转移灶时，治疗选择非常有限，毒性累积和疗效不佳构成了巨大的临床挑战。局部治疗策略，如腹腔内（Intraperitoneal, IP）化疗，虽显示出潜力，但在LGSOC中的应用尚未得到系统评估。

为了解决LGSOC的耐药机制并探索更有效的治疗策略，一项发表在《npj Precision Oncology》上的开创性研究，对两名接受新型局部治疗——加压腹腔内气溶胶化疗（Pressurized Intraperitoneal Aerosol Chemotherapy, PIPAC）的LGSOC患者进行了前所未有的纵向追踪。PIPAC技术通过腹腔镜手术，将化疗药物（本研究中使用顺铂和多柔比星）以气溶胶形式直接喷洒到腹腔，利用高压和二氧化碳气腹改善药物在腹膜转移灶中的分布和渗透。这种方法的独特优势在于，它允许在每个治疗周期前后重复获取肿瘤组织样本，为实时、动态地观察肿瘤在治疗压力下的演化提供了宝贵机会。

本研究的关键技术方法主要包括：1）基于临床队列（两名经多线治疗后的复发LGSOC患者）的纵向样本采集，在每次PIPAC周期中从腹腔多个象限获取肿瘤活检组织；2）利用单细胞核RNA测序（snRNA-seq）技术对收集的15个肿瘤样本进行高通量转录组分析，克服实体瘤解离难题，捕获恶性细胞及肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中其他细胞的分子图谱；3）采用生物信息学方法（如ssGSEA、线性模型、奇异值分解和共识聚类）进行通路活性分析、时序动态建模和细胞原型（Archetype）鉴定；4）通过多重免疫荧光染色对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行免疫细胞（如T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞）的定量分析，以验证和补充测序发现。

结果

临床特征与PIPAC疗效

研究纳入的两名患者均为晚期复发LGSOC，并经过多线治疗。一名69岁患者（非应答者）携带NRAS突变，在接受2个周期PIPAC后出现肝转移等肝外进展。另一名59岁患者（应答者）无显著靶向突变，完成了6个周期PIPAC治疗，影像学评估达到部分缓解，肿瘤标志物CA-125水平显著下降，腹水消失，组织学检查显示肿瘤细胞减少和纤维化增加。单细胞核RNA测序最终分析了来自10个（应答者）和5个（非应答者）活检样本的18,351个高质量细胞，涵盖了癌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、脂肪细胞以及数量有限的免疫细胞（如巨噬细胞和T细胞）。

通路活性变化

对通路活性的时序分析揭示了截然不同的模式。在非应答者中，随着治疗进行，与增殖相关的通路（E2F靶点、G2/M检查点、MYC靶点V1）以及KRAS信号通路、上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT）、血管生成和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）均显著上调，同时雌激素反应通路下调。关键应激基因如HSP90B1和ATF4的表达增加。这表明肿瘤在面对治疗压力时，转向了更具侵袭性、增殖旺盛且应激适应能力增强的表型。

相反，在应答者中，上述增殖通路活性显著降低，EMT也受到抑制。然而，替代性的生存通路，如PI3K/AKT、Wnt/β-连环蛋白（Wnt/β-catenin）和Notch信号通路活性则出现上调。例如，PTEN表达上调，而PIK3R3和JNK（MAPK8/10）等基因表达增加。UPR相关基因下调。这表明成功的治疗虽然抑制了经典增殖途径，但肿瘤细胞可能激活了其他补偿性生存机制。

细胞原型的鉴定与表征

为了解析肿瘤异质性，研究人员通过聚类分析识别出不同的癌细胞原型。跨患者分析确定了两个主要原型：一个富集于PI3K信号和免疫相关通路（PI3K/免疫原型），另一个富集于多种代谢通路（代谢原型）。在应答者中，癌细胞群体在治疗过程中呈现非线性动态变化，代谢原型比例先升后降，而PI3K/免疫原型最终占据主导。在非应答者中，除了上述两个原型，还鉴定出一个与蛋白质翻译和核糖体生物发生相关的原型（翻译原型），且PI3K/免疫原型始终占主导，翻译原型在治疗期间有所扩张。拷贝数变异分析进一步提示，这种表型的动态变化可能与基因型的非线性选择同步发生。

免疫微环境的差异变化

由于snRNA-seq中检测到的免疫细胞数量有限，研究通过免疫荧光进行了补充分析。结果显示，非应答者的肿瘤微环境中，调节性T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）在CD4⁺T细胞中的比例（34.7%）远高于应答者（5.8%），并且在治疗期间持续升高。巨噬细胞在非应答者肿瘤非癌细胞中的比例（31.6%）也显著高于应答者（11.5%）。这表明非应答者存在更为显著的免疫抑制微环境，可能削弱了治疗效果。

结论与讨论

本研究首次在LGSOC中利用PIPAC治疗提供的独特机会，实现了在单细胞分辨率下对多周期化疗反应的纵向分子追踪。研究清晰地表明，治疗应答与失败伴随着截然不同的肿瘤细胞内在通路重编程和肿瘤微环境重塑。

对于治疗无效的患者，肿瘤表现出强大的适应性，通过增强增殖、激活KRAS信号、EMT、UPR以及维持PI3K信号活性来抵抗化疗。同时，免疫抑制性细胞（Tregs和巨噬细胞）的大量浸润可能进一步助长了耐药性。而治疗有效的患者，虽然经典增殖通路被成功抑制，但肿瘤细胞似乎尝试通过激活PI3K、Wnt/β-catenin和Notch等替代通路来寻求生存，然而持续的化疗压力最终可能导致其无法维持，并伴随着免疫抑制程度的相对减轻。细胞原型的动态演变进一步强调了肿瘤异质性和可塑性在治疗响应中的关键作用。

这些发现具有重要的临床意义。首先，它们揭示了LGSOC耐药的复杂性，单一靶向药物（如MEK抑制剂）可能不足以实现持久疾病控制，因为肿瘤细胞会通过激活替代通路（如PI3K）等方式逃逸。其次，研究强调了靶向肿瘤微环境，特别是解除免疫抑制（如靶向巨噬细胞或清除Tregs），可能是增强化疗疗效的有效策略。因此，未来针对LGSOC的治疗可能需要采取多靶点、适应性的联合策略，同时打击增殖、生存、应激和免疫 evasion 等多个环节。

尽管本研究作为探索性分析，样本量小（仅两名患者），但其提供的深入见解为后续更大规模的研究奠定了坚实基础。它凸显了在治疗过程中进行实时分子监测的重要性，以指导精准的联合治疗决策，从而应对这一棘手癌症类型的进化挑战。