铜绿假单胞菌生物膜与浮游生活方式通过调节脂质A结构和炎症反应影响囊性纤维化患者感染进程

《Scientific Reports》：Biofilm and planktonic lifestyles modulate lipid A structure and inflammatory response in Pseudomonas aeruginosa from people with cystic fibrosis

本研究针对囊性纤维化(CF)患者感染中铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的抗生素耐药性难题，通过比较临床分离的野生型(WT)和泛耐药(PDR)菌株在浮游和生物膜(Biofilm)两种生长状态下脂质A(Lipid A)的结构差异及其对炎症反应的影响。研究发现生物膜生长促使脂质A单磷酸化程度增加，TLR4/NF-κB通路激活增强，胶原1A1(COL1A1)表达上调，揭示了脂质A结构修饰在慢性感染免疫逃逸和纤维化进程中的关键作用，为CF感染治疗提供了新靶点。

　　

在医学感染领域，细菌生物膜如同一座坚固的堡垒，让抗生素难以攻破，导致慢性感染反复发作。其中，囊性纤维化(CF)患者的肺部更是成为了细菌的"温床"，而铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)则是这里最常见的"顽固分子"。这种革兰氏阴性菌通过形成生物膜，不仅能抵抗抗生素的进攻，还能巧妙躲避人体免疫系统的追捕，使得CF患者的肺部感染往往从急性转为慢性，最终导致肺功能不可逆的损伤。

为什么生物膜中的铜绿假单胞菌如此难以清除？研究人员将目光投向了细菌表面的脂多糖(LPS)，特别是其疏水端——脂质A(Lipid A)。这个看似微小的分子结构，实则是细菌与宿主免疫系统对话的关键"语言"。当脂质A与人体免疫细胞表面的TLR4/MD-2受体结合时，就会像钥匙打开锁一样，启动一系列炎症反应。然而，聪明的细菌在长期与宿主博弈的过程中，学会了"伪装"自己的脂质A，通过改变其磷酸化和酰化程度来降低免疫系统的识别能力。

为了解开这个谜团，来自意大利研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项创新性研究。他们收集了来自CF患者不同感染阶段的临床菌株：一个是来自新近感染(<12个月)患者的野生型(WT)菌株，对测试的所有抗生素都敏感；另一个是来自慢性感染(4-15年)患者的泛耐药(PDR)菌株。研究人员将这些菌株分别在浮游和生物膜两种状态下培养，并与参考菌株PA14进行比较，深入探究了脂质A结构变化与抗生素耐药性及炎症反应之间的关系。

研究团队运用了一系列关键技术方法：通过热酚水法提取LPS，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)分析脂质A结构，利用小鼠原代肺成纤维细胞模型评估炎症反应，通过实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(WB)检测基因和蛋白表达水平，并使用THP1-Blue细胞系进行NF-κB通路活性分析。

LPS的分离与表征

研究人员首先从两种生长状态的菌株中提取并纯化了LPS。电泳分析显示，PA14和WT4菌株产生了光滑型LPS，而PDR7菌株无论在浮游还是生物膜状态下都缺乏O-链，产生粗糙型LPS。糖组成分析表明所有LPS都含有鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、葡萄糖胺(GlcN)和2-酮基-3-脱氧辛酸(Kdo)等特征性单糖。

脂质A结构分析

通过MALDI-TOF质谱分析，研究人员发现了脂质A结构的显著差异。在浮游状态下，PA14和WT4菌株的主要脂质A形式是双磷酸化五酰化结构，而转变为生物膜生活方式后，单磷酸化物种成为主导。更为有趣的是，来自慢性感染患者的PDR7菌株还显示出独特的酰化模式，其六酰化脂质A中含有十六烷酸(C16:0)，这是在CF患者分离菌株中特有的特征。

细胞活力评估

细胞毒性实验显示，所有测试浓度的LPS和脂质A在24小时和48小时处理下均未表现出明显细胞毒性，细胞活力均保持在69%以上，确保了后续炎症反应实验的可靠性。

基因表达分析

炎症相关基因的表达分析揭示了重要发现。IL-6、TLR-4和COL1A1基因在所有处理组中均显著上调，其中生物膜来源的LPS和脂质A表现出更强的激活能力。特别是在10μg/mL浓度下，PDR7菌株生物膜来源的脂质A使IL-6基因表达上调约45倍，而100μg/mL浓度下，B.WT4和B.PDR7的脂质A处理使COL1A1表达上调近100倍。

NF-κB通路激活

通过THP1-Blue实验检测NF-κB活性发现，生物膜来源的分子，特别是来自PDR7菌株的LPS和脂质A，能够显著增强NF-κB的激活。在100μg/mL浓度下，B.PDR7的LPS和脂质A使NF-κB活性提高超过3倍。

蛋白表达验证

蛋白质水平的研究进一步证实了基因表达的结果。Western blotting分析显示，生物膜来源的LPS和脂质A能够显著上调COL1A1、NF-κB和caspase-4的蛋白表达。其中，B.PDR7的LPS处理使NF-κB表达上调1.7倍，caspase-4上调2.3倍。

IL-6蛋白分泌

ELISA实验检测IL-6蛋白分泌发现，生物膜来源的分子诱导了更强的炎症反应。B.PDR7的脂质A在100μg/mL浓度下使IL-6分泌增加约60倍，显著高于相应浮游状态的处理组。

研究结论与讨论部分指出，铜绿假单胞菌通过调节脂质A的磷酸化状态来适应不同生长环境是其生存策略的重要组成部分。从浮游状态向生物膜生活方式的转变伴随着脂质A从双磷酸化向单磷酸化为主的转变，这种结构修饰减少了细菌膜表面的负电荷，有助于细菌逃避宿主免疫识别和阳离子抗生素(如多粘菌素B和粘菌素)的攻击。

值得注意的是，来自慢性感染患者的PDR7菌株还表现出独特的脂质A酰化模式，包括含有C16:0的六酰化结构，这可能是长期适应CF肺部环境的结果。这种结构变化与PhoP/PhoQ和PmrA/PmrB等调控系统的突变相关，这些系统能够感知环境压力并相应调整脂质A结构。

研究的创新性在于首次系统比较了来自CF患者不同感染阶段菌株在两种生长状态下的脂质A结构及其免疫调节功能，揭示了脂质A修饰与抗生素耐药性和炎症反应之间的内在联系。特别是发现生物膜来源的脂质A能够更强地激活TLR4/NF-κB通路，上调COL1A1表达，这为理解CF肺部纤维化进程提供了新的视角。

然而，研究也存在一定局限性，如分析的菌株数量有限，且所有菌株都表现为非黏液型表型，而CF慢性感染中常见的黏液型菌株可能具有不同的LPS结构和免疫原性。未来研究需要扩大样本量，并纳入黏液型菌株进行更全面的比较。

这项研究深化了我们对铜绿假单胞菌在CF肺部适应机制的理解，为开发针对脂质A结构修饰的新型治疗策略提供了理论基础，对于改善CF患者感染管理具有重要意义。通过靶向调节脂质A的修饰酶系统，可能有望打破细菌的免疫逃逸机制，为顽固性生物膜感染的治疗开辟新途径。