在细胞信号传导领域，Frizzled（FZD）家族受体作为WNT信号通路的关键组成部分，在胚胎发育、组织稳态和癌症发生中扮演着重要角色。尽管FZD受体具有巨大的治疗潜力，尤其是FZD7在肠道肿瘤发生中的关键作用已得到确认，但长期以来，针对这类G蛋白偶联受体（GPCR）的小分子药物开发却进展缓慢。传统的药物开发方法在靶向FZD受体时面临巨大挑战，部分原因在于对其三维结构和激活机制的理解不足。近年来，随着冷冻电镜（cryo-EM）技术的发展，科学家们得以获得FZD7的高分辨率结构信息，这为基于结构的药物设计提供了新的机遇。特别是对FZD7的失活和激活状态结构的解析，为了解受体动态变化和潜在药物靶点奠定了基础。然而，迄今为止，尚未有经过验证的、有效的FZD靶向小分子化合物被报道，也没有明确的配体结合位点被确定。p=0.0004,*p<0.0001 A: Scheme created in BioRender. Kinsolving, J.(2025), https:// BioRender.com/8drrhgy. C: Scheme created in BioRender. Gratz, L.(2025) https://BioRender.com/mvf137p. Source data are provided as a Source Data file.'>在这项发表于《Nature Communications》的研究中，Magdalena M. Scharf等人采用综合性的研究方法，成功发现了首个靶向FZD7跨膜结构域核心的小分子负性变构调节剂。研究团队结合计算机对接筛选、药理学分析、基因编码生物传感器、位点定向突变、冷冻电镜和分子动力学模拟等多种技术手段，不仅验证了先导化合物C407的结合位点和作用机制，还深入探讨了其对WNT信号通路的调节功能。关键技术方法包括：基于SMO模板配体的对接设置优化、大规模分子库对接筛选（ZINC15数据库约1170万个分子）、BRET（生物发光共振能量转移）竞争结合实验、TOPFlash报告基因检测、FZD-DEP-Clamp构象生物传感器、点突变功能验证、冷冻电镜结构解析（分辨率2.5?）以及300纳秒分子动力学模拟。Docking screens to the 7TMD of FZD7 revealed a small molecule ligand of FZD7研究人员首先利用FZD7的冷冻电镜结构（PDB ID 7EVW，现为8YY8）作为对接计算的基础。为了确定FZD7中潜在的小分子结合位点，团队采用了基于Smoothened（SMO）结构的模板配体方法。通过将FZD7结构与四个不同的SMO配体复合物对齐，创建了四种不同的对接设置，覆盖了受体跨膜结构域的不同区域。这些设置包括两个靠近胞外侧的潜在结合位点（sagFZD7/SAG1.5和cycloFZD7/cyclopamine）、一个中间位置（visFZD7/vismodegib）以及一个位于7TMD深处的结合位点（santFZD7/SANT-1）。通过对ZINC15药物样（超过900万分子）和先导样（超过250万分子）库进行大规模对接筛选，研究人员从八个对接筛选中视觉评估了排名前500的分子构象，最终选择了22个分子进行购买和细胞实验验证。使用基于BRET的配体置换实验，他们发现了一个先导分子C45，该分子能够以浓度依赖的方式置换示踪配体BODIPY标记的cyclopamine，尽管其效力相对较低（pIC50值为4.58±0.09）。Hit optimisation of C45 uncovers another FZD7-targeting small molecule基于C45的成功，研究团队进行了后续的计算机筛选，使用化学生物学联盟瑞典（CBCS）提供的分子库。通过筛选与C45相似度（ECFP4 tanimoto相似度大于0.4）的分子，并利用C45的对接构象作为模板，他们发现了另一个FZD7靶向小分子C407。与C45相比，C407显示出略微改善的结合活性（pIC50=4.86±0.04）。进一步的类似物筛选发现了更多具有相似分子核心骨架的FZD7配体，包括C471、C472、C473、C475和C477。Compounds act as FZD7-targeting negative allosteric modulators of WNT-induced signalling为了评估这些先导分子对FZD7介导的信号传导的药理效应，研究人员采用了TOPFlash报告基因实验。结果显示，多个化合物能够显著降低WNT-3A诱导的β-catenin信号传导，其中C407、C472、C475和C477被确认为WNT-3A诱导的β-catenin信号的负调节剂。值得注意的是，C407不影响DVL过表达诱导的TOPFlash反应，表明其作用特异性地位于FZD7水平。C407 effect is mediated via a binding site in the FZD 7TMD core通过FZD-DEP-Clamp生物传感器实验，研究人员证实C407直接作用于FZD7，影响WNT-3A诱导的构象重排。位点定向突变实验进一步验证了对接预测的结合位点：将Y4896x51突变为苯丙氨酸或丙氨酸后，C407对WNT-3A诱导的BRET变化的影响被消除。此外，C407对测试的FZD旁系同源物（FZD2、FZD4和FZD5）表现出相似的效果，表明其缺乏旁系同源物选择性，这与FZD在该区域的进化保守性一致。
Structural elucidation of putative C407 interactions为了获得C407与FZD7结合的更详细信息，研究人员解析了FZD7与C407复合物的冷冻电镜结构。虽然获得的2.5?分辨率重建显示7TMD腔内存在非蛋白质密度，且该密度与预测的C407结合位点一致，但由于密度较弱，无法明确地将该密度归属于C407。这种不确定性可能源于C407与FZD7的低亲和力导致的低占据率，或者是化合物在结合位点内的多种结合构象。MD simulations reveal a rearrangement of C407 in the binding site分子动力学模拟显示，无论从对接预测的构象还是基于冷冻电镜数据建模的构象开始，C407在结合位点内都会发生重排，移动到FZD7的7TMD核心更深处。这种运动在从对接构象开始的模拟中表现为突然的重新定向，而在从冷冻电镜构象开始的模拟中则较为渐进。最终，C407在两种模拟中都达到了一个更深的结合位置，与残基H3032x58和S3513x40形成稳定的极性相互作用。C407 binding poses uncovered by MD simulations can be confirmed pharmacologically对MD模拟中C407结合构象的分析揭示了与S3513x40的高频相互作用，这一相互作用只有在C407移动到受体核心深处时才能形成。通过将S3513x40突变为丙氨酸，研究人员证实了这一相互作用的功能重要性：突变后，C407对WNT诱导的传感器重排不再产生任何影响。MD simulations reveal a potential mechanism of action of C407MD模拟还揭示了C407的潜在作用机制。在从对接构象开始的模拟中，C407的氟苯基部分插入TM3和TM6之间，这导致分子开关残基W3543x43和Y4786x40的构象重排，破坏了它们之间的芳香-芳香堆积相互作用。这种构象重排仅在C407存在时观察到，而在apo受体的模拟中未见。将Y4786x40突变为丙氨酸后，C407的效果消失，进一步支持了这一作用机制。本研究通过综合运用计算机辅助药物设计、生物物理方法和细胞药理学分析，成功发现了首个靶向FZD7跨膜结构域核心的小分子负性变构调节剂C407。研究不仅验证了其结合位点和作用机制，还揭示了其通过影响保守的分子开关网络来调节受体功能的独特方式。
p=0.0004,*p<0.0001 A: Scheme created in BioRender. Kinsolving, J.(2025), https:// BioRender.com/8drrhgy. C: Scheme created in BioRender. Gratz, L.(2025) https://BioRender.com/mvf137p. Source data are provided as a Source Data file.'>
