结核分枝杆菌氧化还原稳态与细胞膜通透性的转录调控分歧决定其对利福平的耐受与超敏

《Nature Communications》：Divergent transcriptional regulation of redox-homeostasis and permeability modulate rifampicin tolerance and sensitivity in Mycobacterium tuberculosis

结核病治疗面临药物耐受性延长疗程的挑战。本研究通过转录调控因子诱导表型筛选结合稳态利福平暴露方法，发现Rv2887通过上调icl1增强耐受性，而blaI通过下调cydA诱导超敏性。这些转录因子通过调控氧化还原稳态和细胞通透性双重机制影响药物敏感性，为开发靶向调控网络的新型抗结核策略提供了新靶点。

　　

结核病是全球重大传染病威胁，其治疗面临严峻挑战。标准治疗方案需要持续4-6个月，对于耐药结核病则需要更长时间。尽管完成全程治疗，仍有约5%的患者治疗失败，另有5%出现复发。这种治疗延迟和疾病复发与结核分枝杆菌的药物耐受性密切相关。

与抗生素耐药性不同，药物耐受性是指细菌群体在致死浓度抗生素下生存能力增强，而最低抑菌浓度变化不大。这种耐受性为耐药突变的选择提供了温床，是结核病控制的重要障碍。结核分枝杆菌通过生理和代谢重塑来抵御药物杀伤，宿主微环境也能通过调节细菌生长和代谢诱导耐受性。然而，这些表型变化的转录调控机制尚不清楚。

近日发表在《Nature Communications》的一项研究深入探索了结核分枝杆菌利福平耐受性和超敏性的转录调控网络。研究团队利用转录调控因子诱导表型筛选技术，结合稳态药物暴露方法，系统鉴定了调控这些表型的关键转录因子及其效应基因，揭示了氧化还原稳态和细胞通透性在决定药物敏感性中的核心作用。

研究采用的关键技术方法包括：转录调控因子诱导表型筛选技术，用于系统评估206个结核分枝杆菌转录因子对药物敏感性的影响；Transwell耐受性-耐药性检测系统，实现稳态药物浓度下的长时间杀伤动力学研究；CRISPR干扰技术，用于特异性敲低目标基因验证其功能；流式细胞术，用于检测细胞通透性和氧化应激状态；以及转录组学分析结合弹性网络回归模型，用于识别与表型相关的关键效应基因。

调控利福平耐受性与超敏性的转录因子鉴定

研究人员首先构建了包含206个结核分枝杆菌转录因子和DNA相互作用蛋白的转录调控因子诱导库，每个菌株表达一个受无水四环素诱导的转录因子，并带有独特的条形码序列。通过竞争性时间杀伤实验，他们鉴定了三个能增强利福平耐受性的转录因子（Rv1359、Rv2887和Rv3833）以及四个诱导超敏性的转录因子（Rv1189、Rv1846c、Rv2069和Rv3736）。这些表型变化不伴随最低抑菌浓度的改变，符合药物耐受性的经典定义。

单个转录因子诱导菌株的时间杀伤动力学

对七个关键转录因子诱导菌株的单独研究表明，诱导超敏性转录因子均显示利福平杀伤加速，其中blaI过表达菌株在第16天被完全灭菌。而耐受性相关转录因子诱导菌株则表现出显著耐受性。通过测量达到2个对数级杀伤所需的最小持续时间，量化了各菌株的耐受/超敏程度，blaI诱导菌株显示最高敏感性，Rv2887诱导菌株显示最高耐受性。

转录谱分析与表型建模

转录组分析结合弹性网络回归识别出与利福平应答相关的关键基因。功能模型显示，与细胞呼吸相关的六个基因表达能显著预测利福平耐受性。其中，cydA和icl1被确证为重要效应基因，分别编码细胞色素bd泛醌氧化酶和异柠檬酸裂解酶。

cydA和icl1对耐受性与超敏性的影响机制

过表达cydA和icl1能增强利福平耐受性，而CRISPRi敲低这些基因则导致超敏性。研究表明，blaI诱导通过下调cydA表达导致超敏性，而Rv2887诱导通过上调icl1表达促进耐受性。这些基因通过调控细菌氧化还原状态影响药物敏感性。

cydA和icl1抑制加剧氧化应激

敲低cydA和icl1均增加细菌对氧化应激的敏感性。cydA敲低菌株在活跃生长期即显示氧化应激升高，利福平暴露进一步加剧该现象。icl1敲低则仅在利福平暴露后显示氧化应激增加。两种敲低菌株均对过氧化氢和甲萘醌敏感，证实它们在维持细胞内氧化还原平衡中的关键作用。

转录因子诱导的细胞壁通透性改变

研究发现sigC和Rv3736两个转录因子通过改变细胞壁通透性诱导超敏性。流式细胞术显示这些菌株对FITC标记利福平的摄取增加。通过筛选通透性相关基因，发现tgs1、fabD、kas操纵子、rocD1和PPE1等基因影响药物积累。其中tgs1敲低导致对利福平、异烟肼和莫西沙星的广泛超敏性。

转录因子表型的部分逆转

通过构建双转化体（同时诱导转录因子并敲低效应基因），研究人员部分逆转了Rv2887的耐受性表型和Rv3736的超敏性表型，证实了这些效应基因在表型形成中的直接作用。

该研究系统阐明了结核分枝杆菌药物耐受性和超敏性的复杂转录调控网络。研究发现不同转录因子可通过调控不同但功能相关的效应基因，诱导相似或相反的药物敏感性表型。例如，Rv2887和blaI通过分别上调和下调不同效应基因（icl1和cydA），对利福平敏感性产生相反影响，尽管这两个基因均参与氧化还原稳态维持。类似地，Rv3736通过差异调控tgs1和Rv3083，共同导致通透性增加和超敏性。

这些发现揭示了药物耐受性/超敏性表型在转录调控层面的复杂性，无法通过研究单个效应基因的活动来完全捕捉。研究鉴定的转录因子和效应基因为开发新型抗结核策略提供了潜在靶点。通过调控这些关键调控网络，可能增强现有药物活性或细菌内药物渗透，为缩短结核病疗程、改善治疗效果开辟了新途径。