真菌Pmt4同源二聚体结构解析揭示其独特调控机制与底物特异性

《Nature Communications》：Structural characterisation of the fungal Pmt4 homodimer

本研究针对真菌O-甘露糖基转移酶PMT家族中Pmt4同源二聚体的结构功能关系这一关键科学问题，通过冷冻电镜技术首次解析了嗜热真菌Pmt4同源二聚体的高分辨率结构，发现其MIR结构域以独特cis方式与跨膜区相互作用，并意外揭示细胞质侧存在保守的Dol-P-Man结合位点。该研究为理解PMT家族底物特异性调控提供了结构基础，对先天性肌营养不良症相关机制研究具有重要启示。

　　

在真核生物细胞的内质网中，蛋白质O-甘露糖基化是一种至关重要的翻译后修饰过程，它如同给蛋白质贴上精致的"糖标签"，参与调控蛋白质折叠、质量控制以及细胞间通讯。执行这一关键任务的"分子工匠"是蛋白O-甘露糖基转移酶（PMT）家族，这些嵌入内质网膜的酶能够将甘露糖从磷酸多萜醇甘露糖（Dol-P-Man）转移至蛋白质底物的丝氨酸/苏氨酸残基上。在模式生物酿酒酵母中，PMT家族成员形成专性二聚体，其中Pmt1-Pmt2异源二聚体和Pmt4同源二聚体承担了绝大部分甘露糖基化功能。然而，科学界长期困惑于：为何这些结构相似的PMT酶会展现不同的底物偏好性？Pmt4同源二聚体如何特异性识别膜蛋白底物？这些问题的答案一直隐藏在分子结构的迷雾中。

为了揭开这些谜团，来自海德堡大学的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。研究人员采用综合性的研究策略，以嗜热真菌（Chaetomium thermophilum）的Pmt4（ctPmt4）为研究对象，通过冷冻电镜（cryo-EM）技术解析了其高分辨率结构，并结合X射线晶体学、天然质谱（native MS）和体内功能实验，系统揭示了Pmt4同源二聚体的独特结构特征和功能机制。

关键技术方法包括：利用冷冻电镜解析ctPmt4同源二聚体的三维结构（分辨率3.2-3.4 ?）；通过X射线晶体学测定Pmt4-MIR结构域的高分辨率结构（1.2-1.3 ?）；应用天然质谱技术分析蛋白质-脂质相互作用；采用酵母遗传学方法进行体内功能验证。

结构分析揭示了Pmt4同源二聚体的整体架构

研究人员首先通过单颗粒冷冻电镜解析了ctPmt4的三维结构，发现其形成对称的同源二聚体。每个Pmt4单体包含11个跨膜结构域（TMDs），其整体折叠与先前报道的Pmt1-Pmt2异源二聚体高度相似。然而，最引人注目的差异出现在MIR结构域的排列方式上：在Pmt4同源二聚体中，MIR结构域以cis方式（与同一亚基的TMDs相互作用）排列，而非Pmt1-Pmt2异源二聚体中的trans方式（与相邻亚基的TMDs相互作用）。这种独特的空间布局可能直接影响底物识别和催化效率。

Pmt4-MIR结构域具有功能重要的β-发夹插入

通过高分辨率晶体结构分析，研究人员发现Pmt4-MIR结构域包含一个独特的β-发夹插入（β-ins），该结构在PMT2家族成员中不存在。体内功能实验表明，破坏β-ins结构的突变会显著损害Pmt4的O-甘露糖基化活性，证明这一特征对酶功能至关重要。特别值得注意的是，人类POMT1中与β-ins稳定相关的W486残基的突变与先天性肌营养不良症相关，提示这一结构特征在进化上的保守性和功能重要性。

PMT家族的活性位点高度保守

结构比较显示，Pmt4的活性位点与Pmt1-Pmt2异源二聚体高度保守，包括底物识别残基和Dol-P产物结合位点。这表明PMT家族成员采用相同的催化机制进行甘露糖基转移反应。然而，Pmt4的底物结合口袋呈现一些细微差异，可能与底物特异性识别相关。

Pmt4在膜细胞质侧结合Dol-P-Man

最出人意料的发现是，研究人员在ctPmt4的细胞质侧发现了一个额外的Dol-P-Man结合位点。通过天然质谱和突变分析，他们证实这一结合位点对于Pmt4的O-甘露糖基化活性至关重要。更引人深思的是，尽管参与结合的残基在不同PMT家族成员中不完全保守，但结构比对显示这一带正电荷的细胞质腔在PMT家族中普遍存在，提示这可能是PMT酶的共同特征。

细胞质侧Dol-P-Man结合对Pmt4功能至关重要

功能实验表明，破坏细胞质侧Dol-P-Man结合位点的突变体虽然仍能正确整合到膜上，但其O-甘露糖基化活性显著降低。这证实了该结合位点的功能相关性，为理解PMT酶的调控机制提供了全新视角。

研究结论与意义

这项研究首次揭示了真菌Pmt4同源二聚体的精细结构，发现了其与已知Pmt1-Pmt2异源二聚体的关键差异，特别是MIR结构域的cis作用模式和独特的β-ins特征。最令人惊讶的是发现了细胞质侧的Dol-P-Man结合位点，这为理解PMT酶的调控机制开辟了新方向。研究人员提出两种可能性：该位点可能是变构调控位点，感知Dol-P-Man的可用性；或者Pmt4可能本身就是长期寻找的Dol-P-Man翻转酶，直接将底物从细胞质侧转运至活性位点。

该研究不仅为理解PMT家族的底物特异性和催化机制提供了结构基础，更重要的是为相关人类疾病的研究提供了新线索。鉴于Pmt4与人类POMT1（与先天性肌营养不良症相关）的同源性，这些发现可能有助于理解疾病相关突变的影响机制。此外，研究中发现的结构特征可能为抗真菌药物设计提供新的靶点。

这项工作的意义远超出基础结构生物学的范畴，它为我们理解糖基化这一基本生物学过程的分子机制提供了重要见解，并为未来针对PMT相关疾病的治疗策略开发奠定了坚实基础。随着更多PMT家族成员及其复合物的结构被解析，我们有望全面揭示蛋白质O-甘露糖基化的精细调控网络，最终实现对这一重要生物学过程的精准调控。