miR-71通过抑制线粒体未折叠蛋白反应(UPRmt)信号通路改善慢性线粒体功能障碍的机制研究

《Nature Communications》：The microRNA miR-71 suppresses maladaptive UPRmt signaling through both cell-autonomous and cell-non-autonomous mechanisms

本研究揭示了在慢性线粒体DNA损伤条件下，microRNA miR-71通过细胞自主和非自主机制抑制病理性UPRmt信号传导的新机制。研究人员发现miR-71在肌肉细胞中受ATFS-1、DAF-16和HIF-1转录因子共同调控，通过靶向降解dve-1转录本和抑制神经肽NLP-52的表达，有效改善肌肉功能并阻断肌肉-胶质细胞间的线粒体应激信号传递。该研究为理解线粒体应激反应的精细调控提供了新视角，为代谢性疾病治疗策略开发提供了潜在靶点。

　　

在细胞这个微小的生命工厂中，线粒体扮演着能量供应中心的角色，但它的功能远不止于此。这些微小的细胞器更像是细胞的"应激传感器"，能够感知环境压力并将信号传递给细胞核和其他组织。当线粒体受损时，细胞会启动一种称为线粒体未折叠蛋白反应(UPR^mt)的自我保护机制，帮助恢复线粒体功能。然而，当损伤持续存在时，这种保护机制可能变得"过度活跃"，反而加剧衰老和代谢性疾病的发展。

就像汽车引擎故障灯一直亮着反而会让人焦虑一样，慢性UPR^mt激活已被证明会促进神经炎症、神经退行性疾病甚至癌症的发展。例如，在乳腺癌患者中，持续激活UPR^mt的癌细胞亚群具有更强的转移能力，与较差的临床预后相关。那么，生物体是如何防止这种"好心办坏事"的应激反应呢？这正是澳大利亚昆士兰大学Steven Zuryn团队在《Nature Communications》上发表的最新研究要回答的问题。

关键技术方法

本研究主要采用秀丽隐杆线虫模型，通过肌肉特异性表达线粒体靶向内切酶(MTSPstI)诱导mtDNA双链断裂。利用小RNA测序筛选应激相关miRNA，通过转基因报告系统验证miR-71与dve-1的靶向关系。采用组织特异性基因表达、RNA干扰和荧光报告系统分析细胞间信号传导。通过RNA测序鉴定miR-71调控的下游靶点，并结合染色质免疫沉淀等技术阐明转录调控机制。

miR-35家族和miR-71在线粒体应激中被诱导

研究人员首先构建了在肌肉细胞中特异性诱导mtDNA双链断裂的线虫模型。通过小RNA测序分析，他们发现了一组在线粒体损伤时显著上调的microRNA，其中miR-35家族成员和miR-71表现最为突出。这种诱导现象不仅存在于mtDNA断裂模型中，在携带不同mtDNA缺失突变(uaDf5和mpt1)以及线粒体DNA聚合酶γ突变(polg-1(srh1))的动物中也得到验证。

特别值得注意的是，miR-71的诱导具有应激特异性——内质网应激或细胞质应激均不能引起其表达变化，表明它是线粒体特异性应激反应的重要组成部分。

miR-71抵抗mtDSBs引起的肌肉细胞功能障碍

当研究人员提高miR-71表达水平时，他们观察到了令人振奋的结果：过度表达miR-71能够显著改善因mtDNA损伤导致的肌肉结构异常和运动功能下降。肌动蛋白丝排列更加整齐，线虫的游泳运动能力也明显恢复。

更重要的是，组织特异性实验表明，miR-71的保护作用具有细胞自主性——仅在肌肉细胞中过度表达miR-71就足以产生保护效果，而在肠道或神经元中的表达则无此作用。这提示miR-71主要在遭受应激的细胞内部发挥作用。

miR-71靶向UPR^mt调节因子dve-1

为了揭示miR-71的作用机制，研究人员通过生物信息学预测和实验验证，发现dve-1是miR-71的直接靶标。DVE-1是UPR^mt的关键转录因子，在线粒体应激时被激活并转入细胞核，启动一系列应激反应基因的表达。

通过构建含有dve-1 3'UTR的荧光报告系统，研究人员证实miR-71能够通过与dve-1 mRNA的3'非翻译区结合，促进其降解。当突变miR-71的结合位点后，这种抑制作用完全消失。在分子水平上，mtDNA损伤导致dve-1转录本增加6倍，而miR-71的过度表达可使其恢复至基础水平。

miR-71对抗过度的UPR^mt激活发挥细胞保护作用

这一发现似乎有些矛盾：既然UPR^mt是保护性反应，为何miR-71要抑制它？研究人员通过一系列精巧实验揭示了其中的奥秘。

他们发现，当人为使UPR^mt关键调节因子ATFS-1持续激活时，反而会加剧mtDNA损伤引起的肌肉功能障碍。这表明在慢性线粒体应激条件下，过度的UPR^mt激活可能是有害的。而miR-71正好充当了"刹车"的角色，通过抑制DVE-1来防止UPR^mt的过度激活。

多个证据支持这一结论：miR-71能够抑制UPR^mt下游标志物hsp-6的表达；敲低dve-1能够模拟miR-71过度表达的保护效果；而破坏miR-71对dve-1的靶向作用则会削弱miR-71的益处。

miR-71受ATFS-1、DAF-16和HIF-1活性的整合调控

那么，细胞是如何确保miR-71只在需要时才被激活呢？研究人员发现，miR-71的诱导存在明显的阈值效应——只有在达到一定程度的线粒体损伤时(如uaDf5异质性水平达到60%而非35%)，miR-71才会被显著诱导。

进一步机制研究表明，三种重要的应激感应转录因子——ATFS-1、DAF-16和HIF-1共同参与了miR-71的转录调控。在线粒体应激时，这三种因子都发生核转位，并结合到mir-71基因的启动子区域。遗传学实验证实，三者都是miR-71完全诱导所必需的，但单独激活任一通路都不足以诱导miR-71表达。

这种多重调控机制可能确保了miR-71只在严重的、慢性的线粒体应激条件下才被激活，从而防止在轻微应激时不适当地抑制保护性UPR^mt。

miR-71抑制从肌肉到胶质细胞的mtDNA损伤细胞非自主信号

除了细胞自主性作用，研究人员还发现了miR-71的一个令人惊讶的功能——调节组织间的线粒体应激信号传递。

他们观察到，肌肉细胞中的mtDNA损伤能够激活远处胶质细胞中的UPR^mt，表现为DVE-1::GFP的核聚集。而miR-71缺失会增强这种细胞间信号传导，过度表达则抑制它。重要的是，这种作用需要miR-71在肌肉细胞中发挥作用，而不是通过miR-71本身在组织间传递。

miR-71抑制肌肉-胶质细胞UPR^mt信号传导所需的肽类

为了找出介导这种细胞间通信的信号分子，研究人员通过RNA测序比较了野生型和miR-71突变体在线粒体应激条件下的基因表达谱。结果发现，miR-71依赖性地抑制了大量神经肽和胰岛素样肽的表达，其中包括已知参与系统性线粒体应激信号传导的INS-27、INS-35、FLP-1和FLP-2等。

通过RNAi筛选，研究人员鉴定出神经肽样蛋白NLP-52是肌肉-胶质细胞信号传导的关键介质。肌肉特异性敲低nlp-52几乎完全阻断了胶质细胞中UPR^mt的激活，而重新在肌肉中表达NLP-52则可恢复这种信号传递。

研究结论与意义

这项研究揭示了microRNA miR-71在线粒体应激调控中的双重功能：一方面，它通过靶向dve-1转录本，在遭受应激的肌肉细胞内部抑制过度的UPR^mt激活；另一方面，它通过抑制神经肽NLP-52的表达，阻断从肌肉到胶质细胞的病理性应激信号传递。

这种精细的调控机制确保了生物体能够根据线粒体损伤的严重程度适时调整应激反应强度——在轻度损伤时允许保护性UPR^mt发挥作用，而在重度慢性损伤时启动抑制机制，防止过度应激反应带来的负面影响。

该研究的发现具有重要的生物学和医学意义。首先，它增进了我们对机体维持线粒体稳态复杂调控网络的理解。其次，它提示针对miR-71或其下游靶点的干预可能成为治疗线粒体相关疾病的新策略。鉴于慢性UPR^mt激活与多种年龄相关疾病密切相关，这一发现为开发延缓衰老过程的新方法提供了线索。

值得注意的是，miR-71在多种生物过程中都发挥重要作用，包括寿命调节、饥饿反应等，这表明它可能是整合多种应激信号的关键节点。在严重线粒体应激时，miR-71调控的基因数量从数百个扩展到数千个，凸显了它在协调机体应激反应中的核心地位。

这项研究不仅揭示了microRNA在调控线粒体应激反应中的新功能，也为理解多组织间通信的分子机制提供了新视角。随着对这类调控机制的深入理解，我们有望开发出更精准地干预线粒体功能障碍相关疾病的新策略。