RHOA通过调控VAPB/PTPIP51复合物调控线粒体-内质网接触位点的机制研究

《Nature Communications》：RHOA regulates mitochondria-ER contact sites through modulation of the VAPB/PTPIP51 tether

本研究揭示了小GTP酶RHOA在动态调控线粒体-内质网接触位点（MERCS）中的关键作用。通过全基因组CRISPRi筛选，研究人员发现RHOA及其CUL3降解通路可调控VAPB/PTPIP51栓系复合物的形成，进而影响细胞钙信号传导和能量代谢。该发现为癌症、神经退行性疾病等MERCS相关疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在真核细胞中，线粒体和内质网这两个重要的细胞器之间存在着密切的物理和功能联系。它们通过特定的膜接触位点——线粒体-内质网接触位点（Mitochondria-ER Contact Sites, MERCS）——进行信息交流和物质交换。这些接触位点如同细胞内的“通信枢纽”，调控着钙离子稳态、磷脂转移、能量代谢和线粒体动力学等多个关键细胞过程。然而，尽管MERCS的功能重要性日益凸显，科学家们对于细胞如何根据不同的生理或病理状态来动态调节这些接触位点的分子机制仍知之甚少。理解MERCS的动态调控机制，对于揭示其在癌症、神经退行性疾病（如肌萎缩侧索硬化症ALS）等人类疾病中的作用至关重要。

为了解开MERCS动态调控的谜团，来自加州理工学院的研究团队在《Nature Communications》上发表了一项重要研究。他们通过创新的筛选方法，发现了一个意想不到的MERCS调控者——一个原本以调控细胞骨架而闻名的蛋白质。

研究人员首先设计了一个巧妙的策略来寻找调控MERCS的基因。他们利用全基因组CRISPR干扰（CRISPRi）技术，在一个携带MERCS报告基因（SpLacZ-MERCS）的细胞系中进行大规模筛选。这个报告基因能够整合活细胞中随时间变化的MERCS信息，从而减少瞬时波动的影响。通过流式细胞术分选MERCS水平高低不同的细胞群体，并对其中富集的向导RNA（sgRNA）进行深度测序分析，他们成功鉴定出了一系列已知的MERCS调控因子，验证了筛选方法的可靠性。

在众多新发现的候选基因中，一个名为RHOA的基因及其相关的降解通路引起了研究人员的特别注意。RHOA是一种小型GTP酶（small GTPase），属于Rho家族，长期以来被认为主要参与调节肌动蛋白细胞骨架、细胞迁移和囊泡运输等过程。其蛋白水平受到CUL3（Cullin 3）E3泛素连接酶复合物的调控，该复合物通过底物适配蛋白BACURD3（又称KCTD10）识别RHOA，并引导其被泛素化降解。筛选结果显示，敲低RHOA会降低MERCS水平，而敲低其负调控因子CUL3或BACURD3则会升高MERCS水平。后续的验证实验，包括使用RHOA抑制剂Rhosin或激活剂Rho Activator II进行处理，均证实了RHOA的活性确实能够双向调节MERCS的水平。为了排除测量方法的局限性，研究团队还采用了三种互补的技术——免疫荧光共定位分析、活细胞超分辨率成像和邻近连接 assay（PLA）——来评估线粒体与内质网的接近程度，结果一致表明操控RHOA可以显著改变MERCS。

既然RHOA能够调节MERCS，那么这种调节是否具有生理功能呢？MERCS的一个核心功能是介导内质网向线粒体的钙离子传输，这对于线粒体能量产生至关重要。研究人员利用靶向内质网（GCaMPer）和线粒体（mito-R-GECO1）的基因编码钙离子指示剂，监测在药物（毒胡萝卜素thapsigargin）或生理性激动剂（组胺histamine）刺激下，钙离子从内质网释放并进入线粒体的过程。结果发现，过表达RHOA或激活内源性RHOA能够显著增强线粒体的钙离子摄取；相反，敲低或抑制RHOA则会削弱这一过程。这表明RHOA通过调节MERCS，直接影响了下游的钙信号传导效率。

接下来，研究人员深入探究了RHOA调控MERCS的具体分子机制。他们首先排除了两种可能的主要间接途径。其一，有报道称RHOA可通过ROCK1激酶磷酸化并激活动力相关蛋白1（DRP1），从而促进线粒体分裂。虽然本研究确认RHOA过表达确实增加了线粒体碎片化，但敲低DRP1并不能阻止RHOA过表达所引起的MERCS增加，说明RHOA对MERCS的调控独立于其对DRP1和线粒体形态的影响。其二，虽然肌动蛋白丝的重组与MERCS形成有关，但药理学破坏肌动蛋白丝并未影响RHOA对MERCS的增强作用，表明其作用也不依赖于肌动蛋白细胞骨架的重排。

那么，RHOA究竟是如何直接作用于MERCS的呢？线索指向了一个关键的MERCS栓系复合物——由内质网蛋白VAPB和线粒体蛋白PTPIP51组成的VAPB/PTPIP51复合物。已有的生物素化标识（BioID）相互作用组学数据提示VAPB可能是RHOA邻近相互作用网络的成员。本研究证实，RHOA调控MERCS的功能严格依赖于VAPB和PTPIP51。一方面，过表达VAPB/PTPIP51能显著增加MERCS，但这种效应在敲低RHOA后被消除；另一方面，RHOA过表达带来的MERCS增加，在敲低VAPB或PTPIP51后也不复存在。细胞定位分析显示，过表达的RHOA-GFP部分定位于内质网，并且过表达VAPB/PTPIP51能促进内源性RHOA向线粒体和内质网的募集。

最关键的证据来自于蛋白质相互作用研究。免疫共沉淀（Co-IP）实验表明，RHOA-GFP能够与内源性的VAPB和PTPIP51结合，但不能与另一个MERCS栓系蛋白PDZD8结合。更重要的是，RHOA的活性状态直接影响VAPB和PTPIP51之间的相互作用。过表达RHOA，特别是其功能获得性突变体RHOAY42C，能够增强VAPB与PTPIP51的邻近连接信号和免疫共沉淀效率；而敲低或抑制RHOA则会减弱内源性VAPB与PTPIP51的结合。这些结果在细胞水平清晰地表明，RHOA通过调节VAPB/PTPIP51栓系复合物的形成来调控MERCS。

为了进一步在分子水平上阐明机制，研究人员尝试用重组蛋白重建这一相互作用。体外pull-down实验证实，RHOA能够直接与VAPB结合，而这种结合是GTP依赖性的：倾向于结合GTP的组成型活性突变体RHOAG14V和RHOAY42C与VAPB的结合更强，而失活突变体RHOAT19N则不能结合；非水解型GTP类似物GPPNHP也能增强结合。有趣的是，在体外重组系统中，RHOA并不直接结合PTPIP51，并且RHOA的存在也不影响VAPB与PTPIP51的直接相互作用。这与在细胞中观察到的RHOA促进VAPB/PTPIP51复合物形成的现象有所不同，提示细胞内的调控可能还需要其他辅助因子、翻译后修饰或膜环境等复杂条件。

本研究还探讨了与疾病相关的基因突变对这一新通路的影响。与弥漫性胃癌相关的RHOAY42C突变体，因其维持GTP结合状态的能力增强，比野生型RHOA更能有效地增加MERCS。导致家族性高钾性高血压的CUL3 Δ9突变体具有显性负效应，会积累RHOA，其过表达也导致MERCS增加。此外，与ALS相关的VAPB P56S突变体，在体外实验中显示出与RHOA和PTPIP51结合能力的严重缺陷。这些发现将RHOA-VAPB/PTPIP51-MERCS调控轴与多种人类疾病联系起来，提示MERCS功能障碍可能是这些疾病的一个共同病理生理环节。

为开展此项研究，作者主要应用了以下几项关键技术：全基因组CRISPRi筛选以发现MERCS调控基因；基于报告基因（SpLacZ-MERCS）和多种成像技术（免疫荧光、超分辨率显微镜、邻近连接 assay）的MERCS定量分析；基于基因编码钙指示剂的活细胞钙离子流检测；以及蛋白质相互作用分析（免疫共沉淀、体外pull-down assay）以阐明分子机制。

研究结果

CRISPRi筛选鉴定出RHOA及其CUL3/BACURD3降解通路为MERCS的调控因子

通过全基因组CRISPRi筛选与MERCS报告基因系统相结合，研究人员成功鉴定出已知的MERCS调控因子，并发现RHOA、CUL3和BACURD3是新的强效候选基因。功能验证表明，降低RHOA活性（通过敲低或药物抑制）减少MERCS，而降低其负调控因子CUL3或BACURD3则增加MERCS，证实RHOA水平是MERCS的关键调节器。

RHOA、CUL3及其疾病突变体调控MERCS

研究人员通过过表达野生型RHOA、组成型活性（G14V, Y42C）或失活（T19N）突变体，以及疾病相关突变体（如胃癌相关的RHOAY42C和高血压相关的CUL3 Δ9），证实了RHOA的活性及其蛋白水平对MERCS的正向调控作用。功能获得性突变体对MERCS的增强效应更为显著。

RHOA控制内质网与线粒体间的钙离子转移

利用靶向细胞器的基因编码钙指示剂，研究发现RHOA的激活增强了在毒胡萝卜素或组胺刺激下，从内质网到线粒体的钙离子传输效率，而抑制RHOA则削弱了这一过程。这表明RHOA调控的MERCS变化直接影响了下游的钙信号传导功能。

RHOA独立于DRP1和肌动蛋白调控MERCS

尽管RHOA影响线粒体形态（分裂），但敲低DRP1并不阻止RHOA对MERCS的增强作用。同样，破坏肌动蛋白丝也不影响RHOA对MERCS的调控。这表明RHOA对MERCS的调控是其独立于细胞骨架相关功能的新功能。

RHOA是ATP合成酶抑制后MERCS重塑所必需的

抑制ATP合成酶的寡霉素（oligomycin A）处理可诱导MERCS增加，这种增加依赖于RHOA的功能，因为抑制RHOA会消除寡霉素的效果。此过程不依赖于DRP1。

VAPB/PTPIP51栓系复合物对MERCS的上调需要RHOA

VAPB/PTPIP51过表达引起的MERCS增加，在RHOA敲低后被消除。反之，RHOA过表达对MERCS的增强作用，在敲低VAPB或PTPIP51后也不复存在。证明RHOA是VAPB/PTPIP51行使栓系功能所必需的。

RHOA调控VAPB/PTPIP51栓系复合物的形成

免疫共沉淀和邻近连接 assay 证明RHOA与VAPB和PTPIP51存在相互作用，并且RHOA的活性状态调控着VAPB与PTPIP51之间的结合效率。RHOA过表达增强，而其敲低或抑制则减弱VAPB/PTPIP51复合物的形成。

RHOA与VAPB直接结合

体外实验证实RHOA直接与VAPB结合，且结合强度依赖于RHOA的GTP结合状态（GTP-dependent）。与ALS相关的VAPB P56S突变体严重损害了其与RHOA和PTPIP51的结合能力。

结论与意义

这项研究首次揭示了RHOA作为关键调控因子，通过直接结合VAPB并调控VAPB/PTPIP51栓系复合物的稳定性，来动态控制线粒体-内质网接触位点（MERCS）的水平。这一发现将RHOA的功能从传统的细胞骨架调控拓展到了细胞器通信领域。研究表明，通过调节RHOA的活性或丰度，可以精细地“调谐”MERCS的程度，进而影响诸如钙信号传导等重要细胞功能，并且在能量应激（如寡霉素处理）条件下诱导的MERCS重塑中也扮演了必需角色。

研究的深刻意义在于，它将一条重要的信号通路（RHOA-CUL3）与一个核心的细胞器栓系复合物（VAPB-PTPIP51）联系起来，为理解MERCS如何响应细胞内信号从而实现动态变化提供了分子机制上的解释。更重要的是，研究发现与癌症（RHOA Y42C）、高血压（CUL3 Δ9）和神经退行性疾病（VAPB P56S）相关的致病突变体均会干扰这一新发现的调控通路，强烈提示MERCS功能障碍可能是这些看似不相关的疾病的一个共同潜在机制。因此，本研究不仅增进了我们对细胞器生物学的基本认识，也为开发针对MERCS相关疾病的新治疗策略（例如靶向RHOA或其降解通路）提供了有价值的理论依据和潜在的干预靶点。