SPOROCYTELESS/NOZZLE与MADS域转录因子协同调控生长素依赖网络控制大孢子母细胞分化的机制研究

《Nature Communications》：SPOROCYTELESS/NOZZLE cooperates with MADS-domain transcription factors to regulate an auxin-dependent network controlling Megaspore-Mother-Cell differentiation

本研究揭示了拟南芥雌配子发育起始的关键调控机制。为解决SPL/NZZ（SPOROCYTELESS/NOZZLE）下游调控网络不清的问题，研究人员通过多组学方法发现SPL/NZZ与MADS域转录因子复合物相互作用，共同调控生长素信号通路关键基因表达。结果表明，SPL/NZZ通过抑制ANT等chalaza基因在珠心异位表达，间接促进PIN1介导的生长素运输，从而激活ARFs依赖的信号传导，最终促成MMC正常分化。该发现为植物生殖发育调控网络提供了重要理论突破。

　　

在开花植物有性生殖过程中，大孢子母细胞（Megaspore Mother Cell, MMC）的分化是雌配子形成的起点，这一过程的精确调控对植物繁殖成功至关重要。拟南芥中，SPOROCYTELESS/NOZZLE（SPL/NZZ）基因被确认为MMC分化的主调控因子，其功能缺失会导致MMC完全缺失，造成雌性不育。然而，长期以来科学界对SPL/NZZ如何调控下游基因表达网络，以及这一网络如何协调MMC分化的分子机制知之甚少。

以往研究虽然发现SPL/NZZ能够与TCP和YABBY家族转录因子相互作用，但这些互作伙伴是否在MMC分化中起关键作用尚不明确。同时，有证据表明生长素信号通路可能参与这一过程，但SPL/NZZ与生长素信号之间的具体联系机制仍有待阐明。这些知识空白限制了我们全面理解植物雌性生殖细胞分化的调控网络。

为解决这些问题，由Alex Cavalleri、Chiara Astori和Silvia Manrique等研究人员组成的国际合作团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们采用多组学整合分析策略，揭示了SPL/NZZ通过与MADS域转录因子形成复合物，调控生长素依赖的下游网络，从而精确控制MMC分化的新机制。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：利用AP1:GR/ap1cal花发育同步诱导系统获得特定发育阶段的材料；通过免疫共沉淀结合质谱分析（Co-IP/MS）鉴定SPL/NZZ的互作蛋白；采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）确定SPL/NZZ的直接靶基因；进行RNA测序（RNA-seq）分析spl-1突变体中的差异表达基因；结合酵母双杂交/三杂交、FRET-FLIM和AlphaFold3结构预测验证蛋白质相互作用；通过构建组织特异性表达转基因株系进行功能互补验证。实验材料主要使用拟南芥哥伦比亚生态型（Col-0）及各种突变体和报告基因株系。

SPL/NZZ和MADS域转录因子相互作用形成多聚体复合物

通过Co-IP/MS分析，研究团队在胚珠发育早期阶段鉴定了660个与SPL/NZZ相互作用的蛋白质。出乎意料的是，MADS域转录因子家族成为最丰富的转录因子类型，占所有互作转录因子的近20%，包括SEEDSTICK（STK）、SHATTERPROOF2（SHP2）、SEPALLATA1（SEP1）、SEPALLATA2（SEP2）、SEPALLATA3（SEP3）和AGAMOUS（AG）等已知参与胚珠发育调控的因子。相比之下，之前报道的TCP家族中仅TCP22被显著富集，而YABBY家族转录因子则未出现在互作列表中。

酵母双杂交和三杂交实验证实了SPL/NZZ与MADS域转录因子之间的直接相互作用。特别值得注意的是，虽然SPL/NZZ与SEP3的直接相互作用较弱，但当STK或AG同时存在时，三者能形成更稳定的复合物。FRET-FLIM实验在植物体内进一步验证了SPL/NZZ与SEP3和STK的物理相互作用，显示共表达SPL/NZZ△-mCHERRY能显著降低SEP3△-GFP或STK-GFP的荧光寿命，表明蛋白质间距离小于10纳米，存在密切互作。

SPL/NZZ和MADS域转录因子共享共同靶基因

ChIP-seq分析确定了197个SPL/NZZ直接靶基因，其中80%的峰位于基因组调控区域。Motif富集分析发现，SPL/NZZ结合区域唯一显著富集的转录因子结合位点是CArG-box，这是MADS域转录因子的典型结合序列。更重要的是，SPL/NZZ与SEP3的ChIP-seq数据集比较显示，超过90%的SPL/NZZ结合位点（对应182个基因）与SEP3结合位点重叠，强烈支持两者在DNA结合层面的协同作用。

为验证MADS域转录因子在MMC分化中的功能，研究人员构建了pSPL/NZZ::MADSas载体，在珠心特异性沉默SEP基因。在shp1 shp2 stk突变背景下表达该构建体，导致25%-45%的胚珠无法形成MMC，虽然表型渗透率低于spl-1突变体，但明确证实了MADS域转录因子与SPL/NZZ在MMC分化中的功能关联。

SPL/NZZ调控生长素信号网络

对SPL/NZZ-SEP3共同靶基因的GO分析显示，这些基因显著富集于生长素代谢和生物合成相关通路。RNA-seq结果进一步证实，spl-1突变体雌蕊中有3375个基因上调表达，其中包含多个生长素生物合成关键基因，如YUCCA2、YUCCA4、YUCCA6和TAA1。这些基因在spl-1突变体中表达增强，与SPL/NZZ作为转录抑制因子的功能一致。

对生长素运输和响应的详细分析发现，野生型胚珠中，从MMC开始分化的2-I期到完全分化的2-III期，PIN1-GFP信号和DR5v2报告基因表达逐渐增强。而在spl-1突变体中，虽然2-I期PIN1表达与野生型相似，但到2-III期时显著降低。同样，DR5v2报告的生长素响应在spl-1突变体中也严重减弱。R2D2报告基因实验显示spl-1珠心中DII-VENUS积累增加，表明生长素水平确实降低。

恢复生长素运输足以挽救spl-1胚珠中的MMC分化

研究人员推测SPL/NZZ可能通过抑制负调控因子间接促进PIN1表达。其中，AINTEGUMENTA（ANT）作为SPL/NZZ-SEP3直接靶基因，引起了特别关注。之前研究表明，ant突变能部分挽救spl/nzz突变体的MMC缺失表型。本研究发现，在ant突变体中，PIN1在胚珠的合点和珠柄部位异位表达，提示ANT可能作为PIN1的间接抑制因子。

为验证这一假设，团队构建了pSPL/NZZ::PIN1载体并在spl-1突变体中表达。令人振奋的是，这一操作几乎完全挽救了spl-1的表型：MMC正常分化并完成大孢子发生，内外珠被正常发育，转基因植株能产生可育配子。有趣的是，虽然MMC和珠被发育得到恢复，但spl-1 pSPL/NZZ::PIN1胚珠的珠柄仍然较长，且ANT在珠心和珠柄中仍异位表达，说明PIN1位于ANT下游，而珠柄伸长表型可能与ANT等基因的持续异位表达有关。

ARFs活性抑制模拟spl-1突变表型

根据生长素响应模型，生长素积累促进Aux/IAA降解，从而释放ARFs（Auxin Response Factors）的活性。研究推测spl-1中生长素水平降低可能导致Aux/IAA稳定性增加，抑制ARFs功能。为验证这一假设，研究人员在野生型珠心表达突变的shy2.6（Aux/IAA3的显性负突变等位基因），该突变体因degron motif突变而抵抗生长素依赖性降解。结果发现，pSPL/NZZ::shy2.6转基因植株确实出现了MMC分化缺陷，模拟了spl-1表型，而PIN1表达模式未受影响，表明表型确实源于ARFs活性抑制而非生长素运输紊乱。

ARFs活性是MMC分化所必需的

单细胞RNA-seq数据显示，在珠心表达的ARFs中，MP（ARF5）、ARF6、ARF8和ARF9能与SHY2相互作用。表达模式分析发现，MP-VENUS在珠心积累，而ARF6和ARF8主要在翻译后水平受调控。ARF9转录本在野生型MMC和珠被中积累，而在spl-1中错误定位。

功能实验表明，在spl-1背景下表达pSPL/NZZ::MP仅能部分恢复MMC分化（约10%的胚珠），且这些细胞不能进行减数分裂。相比之下，pSPL/NZZ::ARF9能显著挽救MMC分化并完成孢子发生，表明ARF9在MMC分化中起关键作用。

本研究系统阐明了SPL/NZZ调控MMC分化的分子机制：SPL/NZZ与MADS域转录因子复合物协同作用，通过抑制ANT等合点基因在珠心的异位表达，解除对PIN1的抑制，促进生长素在珠尖积累，进而激活ARFs介导的转录程序，最终驱动MMC正常分化。这一发现不仅深化了对植物生殖发育调控网络的理解，也为解析类似细胞命运决定机制提供了重要参考。值得注意的是，pSPL/NZZ::PIN1和pSPL/NZZ::ARF9也能挽救spl-1突变体的花粉形成缺陷，提示类似的调控机制可能也作用于雄配子发育，为研究植物有性生殖的保守调控机制开辟了新方向。