微管介导信号转导的结构基础：C1结构域作为时空信号传感器的分子机制

《Cell》：Structural basis of microtubule-mediated signal transduction

本研究揭示了微管作为上游信号传感器的分子机制，通过解析GEFH1 C1结构域与微管复合物的冷冻电镜结构，发现了一种跨原纤维结合模式。研究人员证明微管通过C1结构域调控多种信号蛋白（包括GEFs、激酶、GAPs和肿瘤抑制因子）的活性，确立了微管作为时空信号整合器的结构基础，为理解细胞信号转导提供了新范式。

　　

在细胞生物学领域，微管长期以来被视为信号传导通路中的下游效应器，被动响应各种分子和机械信号。然而越来越多的证据表明，动态微管同样可以作为上游信号 mediator，调控包括Rho、Hedgehog、Wnt、Jnk和G蛋白在内的多种信号通路。这种双重角色使微管能够整合和处理多样信号，影响细胞分化、运动、极化、增殖、机械转导、衰老、凋亡和免疫应答等关键细胞过程。尽管这一现象已被认识数十年，但微管调控这些信号蛋白的具体分子机制仍不清楚。

为了解决这一基础性问题，研究人员将目光投向GEFH1（也称Arhgef2或Lfc），这是一种关键的微管调控的Rho信号通路激活剂。Rho GTP酶家族介导微管和肌动蛋白丝之间的交叉对话，影响细胞运动性。研究表明，微管聚合动力学可以调节Rho GTP酶活性：在迁移细胞的前沿，微管生长诱导Rac1依赖的肌动蛋白缆形成；而在细胞尾部，微管收缩激活RhoA，促进肌动蛋白应力纤维形成和actomyosin介导的收缩性。GEFH1在时空上连接微管动力学与RhoA信号传导，促进actomyosin收缩性和细胞迁移。

本研究通过结合结构生物学、生物物理学、生物化学和细胞生物学方法，阐明了微管调控GEFH1及其他信号蛋白的分子机制，建立了理解微管如何作为时空信号传感器的结构框架。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过SEC-MALS分析蛋白质寡聚化状态；利用冷冻电镜解析微管-C1结构域复合物结构（分辨率约3.3-3.5?）；采用溶液NMR测定GEFH1 C1结构域的三维结构；通过SAXS分析蛋白质溶液构象；建立微管共沉淀实验评估结合亲和力；使用细胞共定位实验和G-LISA检测RhoA活性；通过流式细胞术分析树突状细胞成熟标志物；利用EdU掺入实验评估细胞增殖。实验使用了来自小鼠骨髓的树突状细胞和多种人源细胞系。

直接结合GEFH1至微管

人GEFH1是一种多结构域蛋白，其结构化域包括锌指（C1）、Dbl同源（DH）、pleckstrin同源（PH）和卷曲螺旋结构域。微管共沉淀实验表明全长GEFH1直接结合微管，且这一相互作用主要由C1结构域介导，侧翼区域如C1-DH连接子和PH结构域起辅助作用。SEC-MALS分析显示GEFH1通过卷曲螺旋结构域形成二聚体，二聚化增强了与微管的结合能力。静电相互作用分析表明，增加盐浓度会削弱C1L-G4与微管的结合，而去除微管C末端尾部显著降低结合，证实微管C末端尾部在这一相互作用中的重要性。

GEFH1 C1结构域的溶液NMR结构

通过溶液NMR光谱解析了GEFH1 C1结构域的结构，显示其为约55个氨基酸长度的球状结构域，具有类似典型C1B结构域的拓扑结构。该结构域包含两个锌指基序，每个由三个半胱氨酸和一个组氨酸（C3H1）配位稳定。与典型C1结构域不同，GEFH1 C1结构域不能结合佛波酯/二酰基甘油，其疏水裂孔中的多个残基被极性残基取代，破坏了典型结合位点。

GEFH1 N末端部分的SAXS分析

SAXS分析表明，GEFH1 Nter片段（包含C1、DH和PH结构域）的催化DH-PH结构域采用紧凑四级结构，但与VAV1不同，GEFH1的C1结构域不与DH-PH结构域形成稳定的分子内相互作用以建立明确的自抑制构象。相反，C1结构域似乎作为自主模块发挥作用。

微管与GEFH1 C1结构域复合物的冷冻电镜分析

冷冻电镜结构揭示C1结构域通过其带正电荷的表面与微管结合，占据相邻原纤维之间的裂隙，同时与两个横向相关的αβ-微管蛋白异源二聚体相互作用。C1结构域的β1-β2和β3-β4环延伸深入原纤维间裂隙，与微管晶格形成特异性相互作用。C1与四个相邻微管蛋白单体（α-、β-、α'-和β'-微管蛋白）相互作用，结合模式涉及氢键和疏水相互作用。这种跨原纤维结合模式类似于CAMSAP1 CKK结构域，但与其他原纤维间结合蛋白如VASH-SVBP和CCP5不同。

微管结合对GEFH1介导的RhoA信号和免疫细胞激活的作用

基于冷冻电镜结构，研究人员设计了破坏微管结合的C1结构域突变体（FL-αβ、FL-α'β'和FL-ββ'）。细胞实验表明这些突变体显著降低了与微管的共定位，类似于先前报道的C53R突变体。G-LISA检测显示，表达FL-α'β'突变体的HeLa细胞活性RhoA（RhoA-GTP）水平增加1.4倍，表明微管结合减少增强了GEFH1活性。在树突状细胞中，FL-α'β'表达显著增加了CD40、CD80、CD86和MHC II类蛋白的表达，达到微管 destabilizing 药物ansamitocin P3诱导的水平。

其他微管相关信号蛋白中的C1结构域

研究发现AKAP13、RASSF1A、RACGAP1和RAF-1的C1结构域也能直接结合微管，而VAV1、PKCζ和p190RhoGEF的C1结构域在测试条件下未显示结合。冷冻电镜证实AKAP13 C1结构域采用分子内二聚体和原纤维间微管结合模式，但结合位点相对于GEFH1 C1有所偏移。

RASSF1A C1结构域的功能作用

对肿瘤抑制因子RASSF1A的研究表明，其C1结构域对微管共定位至关重要。癌症相关的单核苷酸多态性突变（C65R和R53A）干扰了RASSF1A与微管的相互作用，并显著增加了细胞增殖，表明RASSF1A在结合微管时发挥肿瘤抑制功能。

本研究建立了微管介导信号传导的结构框架，支持"微管 sequestration-and-release"（MSR）模型作为这一调控过程的概念基础。研究发现C1结构域是GEFH1与微管直接特异性相互作用的主要介质，而卷曲螺旋介导的二聚化以及碱性C1-DH连接子和PH结构域显著增强了C1结构域的微管结合能力。

结构分析揭示GEFH1 C1的关键微管结合残基集中在结构域的β1-β4区域，这是典型C1结构域中佛波酯/二酰基甘油的结合位点，表明在GEFH1的非典型C1结构域中，配体结合位点被进化重编程用于微管相互作用。独特的结合模式使GEFH1能够探测与弯曲、拉伸、扭曲和压缩相关的晶格构象变化。

理性突变GEFH1 C1结构域中的关键微管相互作用残基显著降低了GEFH1-微管结合，导致哺乳动物细胞中RhoA活性增加，阐明了微管如何通过隔离GEFH1来调节活性RhoA水平。跨原纤维结合模式进一步阐明了GEFH1如何独立于RhoA激活促进微管稳定性。

从微管释放GEFH1及其随后激活RhoA具有重要细胞后果。例如，ansamitocin P3诱导的GEFH1 dissociation促进树突状细胞成熟和抗原交叉呈递。值得注意的是，研究人员能够使用理性设计的微管结合缺陷GEFH1突变体重现这一表型，表明微管晶格直接调控RhoA介导的细胞过程。这一见解对新抗原癌症疫苗开发和抗肿瘤免疫治疗具有重要意义。

除了微管动力学，磷酸化和乙酰化等因素也影响GEFH1的微管结合特性。C1-DH连接子中靠近C1结构域的PAR-1/MARK磷酸化位点可能通过引入与微管蛋白带负电C末端尾部的静电排斥，或通过与C1和/或PH结构域相互作用 sterically 干扰微管结合来释放GEFH1。类似地，α-微管蛋白Lys40乙酰化通过促进微管在遇到 stiff 底物（如 focal adhesions）时弯曲，促进GEFH1释放和RhoA通路激活。

研究发现AKAP13、p190RhoGEF、RASSF1A、RACGAP1、RAF-1和PKCζ等信号蛋白中的C1结构域也能与微管结合，这些蛋白参与关键信号通路，包括Rho、Jnk、ERK、Wnt、Hedgehog和Hippo，调控细胞分裂、细胞周期进程、增殖、分化、细胞骨架重组、代谢、存活、凋亡和致癌转化等基本细胞过程。序列分析和结构信息表明这些C1结构域的确切微管结合模式存在差异，值得进一步详细结构研究。

总之，本研究建立了微管介导信号传导的结构框架，解决了多样信号蛋白如何与微管结合并被微管调控这一基本问题，从而重新概念化微管作为时空信号传感器，在信号通路中既作为接收器又作为介导器发挥作用。这些发现为系统研究微管基信号整合和处理铺平了道路，可能阐明动态微管在形态稳定细胞（如组织中的细胞）中的主要角色是否是维持细胞内信号稳态，并可能揭示受体介导和微管介导信号传导之间的潜在双向交叉对话，以同时控制和协调不同信号通路。