组蛋白H2A/H2B点突变文库揭示其在果蝇发育、基因组稳定性及免疫中的关键功能

《Cell Reports》：A histone H2A and H2B point mutant library defines essential in vivo functions in Drosophila

本研究针对多细胞生物体内组蛋白H2A/H2B位点特异性功能不清的问题，利用CRISPR-Cas9/φC31整合酶系统构建了系统性果蝇H2A/H2B点突变文库，涵盖30个保守位点。研究发现约40%突变导致发育致死，并揭示特定残基在DNA损伤应答、转座子沉默、Polycomb基因沉默及先天免疫中的关键作用，为染色质生物学提供了重要资源。

　　

在真核生物中，染色质作为遗传信息的载体，其动态调控对基因表达、DNA修复和细胞命运决定至关重要。核小体是染色质的基本单位，由约147 bp DNA缠绕在组蛋白八聚体（包含H2A、H2B、H3和H4各两个分子）上构成。组蛋白不仅参与DNA的压缩，其末端和核心域残基还可发生多种翻译后修饰（post-translational modifications, PTMs），如乙酰化、甲基化、泛素化和磷酸化，这些修饰通过改变染色质结构或招募效应复合物，在表观遗传调控中发挥核心作用。

尽管组蛋白H3和H4的功能已被广泛研究，但H2A和H2B在多细胞生物体内的位点特异性功能仍知之甚少。这主要是由于组蛋白基因簇具有高度重复性和冗余性，使得在体（in vivo）功能解析面临技术挑战。例如，H2AK119ub（泛素化）和H2BK120ub是已知的重要修饰，分别参与Polycomb介导的基因沉默和转录延伸调控，然而大多数研究集中于催化这些修饰的酶，而非组蛋白本身的直接功能。尤其在果蝇（Drosophila melanogaster）这类模式生物中，其组蛋白基因以约100个串联重复的形式存在于单一基因座，为遗传操作提供了独特机会，但也增加了功能研究的难度。

为了填补这一空白，Sun等人基于前期建立的H3/H4突变文库，将研究扩展至H2A和H2B。他们利用CRISPR-Cas9介导的内源性组蛋白基因簇删除，结合φC31整合酶介导的双位点整合系统，成功构建了一个包含30个保守位点的H2A/H2B点突变文库（每个位点突变为丙氨酸）。该文库旨在系统性解析这些残基在发育、生育力、基因组稳定性、免疫应答等生命过程中的作用。

本研究的关键技术方法主要包括：利用CRISPR-Cas9/φC31整合酶系统构建果蝇组蛋白H2A/H2B点突变文库；通过发育表型分析、生育力测试、DNA损伤敏感性筛选（UV和X射线照射）、转座子表达检测（RT-qPCR）、镶嵌体分析（wing disc staining）、免疫印迹（Western blot）以及RNA测序（RNA-seq）等技术，系统性评估突变体的表型和分子变化；所有果蝇突变体系均来源于上海科技大学和苏州大学构建的转基因品系。

发育表型揭示组蛋白H2A和H2B残基的阶段特异性必需性

通过对30个突变系的系统表型分析，发现12个突变（约40%）导致纯合致死，显示了这些残基在果蝇发育中的不可或缺性。利用GFP标记的平衡染色体，研究精确追踪了致死阶段：7个突变导致胚胎致死（如H2AR28A、H2AR76A），4个导致幼虫致死（如H2AK35A、H2AT100A），1个导致蛹期致死（H2BR96A）。此外，部分突变（如H2AR3A、H2AK94A）虽可产生成年个体，但后代数量显著减少，表明其生殖适应性受损。这些结果突出了保守H2A/H2B残基在发育不同阶段的特异性需求。

组蛋白H2A和H2B突变损害雌性生育力和性腺发育

针对可存活突变体的生育力评估显示，H2AR3A、H2AK94A、H2BK3A等突变导致雌性几乎完全不育，而雄性生育力基本正常，表明这些残基的功能存在性别特异性。解剖学分析发现不育突变体的卵巢形态严重异常，包括发育不全和组织结构紊乱，提示特定H2A/H2B残基对生殖系染色质调控和卵子发生至关重要。

组蛋白突变削弱DNA损伤应答

通过UV敏感性筛选，研究发现H2AK118A、H2AK94A和H2BR96A等突变体对UV照射表现出高度敏感，其中H2BR96A在UV处理后完全致死。进一步机制探讨发现，UV照射后对照组中γH2Av和H2BK120ub水平升高，但H2BR96A突变体中H2BK120ub的诱导缺失，表明该残基在DNA损伤应答中特异性参与H2B泛素化调控。这些结果提示特定H2A/H2B残基通过影响染色质重塑和修复因子招募，在维持基因组稳定性中发挥关键作用。

组蛋白突变破坏逆转录转座子沉默

研究以Copia逆转录转座子为报告基因，筛选发现H2AK12A、H2BS5A、H2BK17A等突变体显著上调Copia表达（H2AK12A突变导致约15倍升高）。扩展分析显示H2AK12A突变还激活了I-element、ZAM等其他转座子，表明H2AK12是异染色质沉默的新调控因子。值得注意的是，H2AK12A突变并未引起H3K9me3、H2AK118ub或H3K27me3等经典抑制标记的全局性改变，提示其可能通过特定机制影响转座子沉默。

H2BR96对Polycomb抑制复合物2介导的染色质沉默至关重要

利用镶嵌体分析技术，研究发现H2BR96A突变导致Hox基因Ubx（Ultrabithorax）沉默失效，伴随H3K27me3水平轻度下降和H3K4me3显著升高。免疫印迹验证了H2BR96A突变体中H3K27me3的减少和H3K4me3的增加，表明该残基对维持PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）介导的抑制性染色质状态至关重要。进一步分析显示H2BR96A突变降低了H2AK118ub水平，但不影响H2BK120ub，提示其可能通过影响PRC1/PRC2交叉对话参与基因沉默调控。

组蛋白H2B的N端尾部突变损害果蝇先天免疫

通过口服感染Pseudomonas entomophila，研究发现H2BK11A、H2BK10A等突变体存活率显著降低。在无菌条件下培养的H2BK11A突变体仍显示免疫缺陷，排除了微生物干扰。RT-qPCR和RNA-seq分析发现H2BK11A突变体基础抗菌肽（AMPs）表达普遍下调，且免疫相关通路（如“先天免疫应答”、“防御反应”）显著富集。尽管缺乏果蝇特异的H2BK11ac抗体，但人类H2BK12ac（同源修饰）的ChIP-seq数据显示该修饰在免疫基因富集，提示H2BK11可能通过调控基础转录影响免疫稳态。

本研究成功构建了首个多细胞生物组蛋白H2A/H2B点突变文库，系统性解析了30个保守残基在发育、生殖、基因组稳定性及免疫中的功能。近半数突变导致发育致死，凸显了核心组蛋白残基的重要性；可存活突变体则揭示了其在转座子沉默、Polycomb沉默和先天免疫等过程中的特异性作用。该文库不仅为染色质生物学研究提供了宝贵资源，还揭示了组蛋白残基功能在物种间的保守性与差异性。例如，H2AK12在果椒中转座子沉默中的作用未见于酵母，而H2BR96对PRC2功能的调控在酵母中也不明显，反映了多细胞生物染色质调控的复杂性。此外，H2BK11在先天免疫中的角色将组蛋白修饰与免疫防御直接联系起来，为理解表观遗传-免疫互作提供了新视角。研究还发现，位于组蛋白折叠域和二聚体-四聚体界面的残基突变多导致严重表型，说明其对核小体稳定性的关键作用；而N端尾部残基则更多参与特异性调控，如果蝇H2B N端结构域（HBR域）在转座子沉默和胚胎发育中的功能。这些发现为后续探索组蛋白在疾病发生、衰老和应激应答中的作用奠定了基础。尽管本研究存在一定局限性（如未覆盖所有潜在重要残基、缺乏部分高分辨率分子实验），但其提供的遗传学平台和表型数据将极大推动染色质生物学和表观遗传学的发展。