基于236个人鼠转录组数据整合计算分析筛选用于肝毒性研究的生理相关性肝细胞系

《Toxicological Sciences》：Computational Integration of In Vivo Single Cell and In Vitro Bulk Transcriptomics Across 236 Human and Mouse Datasets Differentiates Physiological versus Non-Physiological Hepatic Cell Lines for Hepatotoxicity Screening

本研究针对体外毒性筛选模型中细胞系生理相关性不足的问题，通过整合分析236个人类和小鼠的体内单细胞与体外批量转录组数据集，系统评估了17种肝细胞系的生理相关性。研究发现HepaRG细胞系在基础转录组和毒性反应上最接近原代肝细胞和体内肝细胞，而广泛使用的HepG2细胞存在明显异质性且偏离生理状态。该研究为肝毒性研究提供了数据驱动的细胞系选择新范式，对提高体外模型的生理相关性和转化价值具有重要意义。

　　

在毒理学研究领域，如何平衡实验可行性与生理相关性一直是科学家们面临的重大挑战。随着新方法（NAMs）的兴起，体外细胞模型逐渐成为动物实验的重要替代方案。然而，选择合适的体外细胞模型却非易事——原代细胞虽然功能接近体内状态，但存在寿命短、供体间变异大等局限性；而永生化细胞系虽可无限增殖，但其 immortalization 过程往往导致功能改变，使其偏离生理状态。

肝脏作为机体化学物质清除的主要器官和众多毒物的靶标，其体外模型的选择尤为关键。目前常用的肝细胞系如HepG2、Hep3B等多源于肝癌组织，其转录组特征与正常肝细胞存在显著差异，这严重影响了肝毒性研究结果的可靠性和转化价值。面对这一困境，加州大学洛杉矶分校的研究团队在《Toxicological Sciences》上发表了一项创新性研究，他们开发了一种基于转录组大数据计算的细胞系筛选方法，为选择生理相关性更高的肝细胞模型提供了科学依据。

研究团队收集了来自Gene Expression Omnibus（GEO）和Single Cell Portal的236个转录组数据集，包括214个体外细胞系和原代细胞数据集以及7个体内单细胞RNA测序（scRNAseq）数据集，涵盖了人类和小鼠的肝细胞、肝星状细胞和胆管细胞。通过统一数据处理流程，包括RNAseq数据的Salmon映射、单细胞数据的Seurat标准化以及跨平台数据的分位数归一化，确保了不同来源数据的可比性。

UMAP和相关性热图分析揭示细胞系与体内肝细胞类型的基因表达相似性/差异性

研究人员首先通过UMAP（均匀流形近似和投影）和Spearman相关性分析，评估了各种肝细胞系与体内肝细胞在基础基因表达模式上的相似性。结果显示，HepaRG细胞系与人类体内肝细胞和原代肝细胞紧密聚集，而HepG2和Huh7等细胞系则明显偏离生理状态。特别值得注意的是，HepG2细胞系形成了两个截然不同的亚群，且这种分化无法通过培养基类型、实验条件或测序平台等常见混杂因素解释，提示该细胞系内部可能存在功能异质性。

差异表达基因分析揭示细胞系与体内细胞类型的转录组相似性和差异

通过Wilcoxon秩和检验进行的差异表达基因（DEGs）分析进一步证实了聚类分析的结果。HepaRG与体内肝细胞相比仅有861个DEGs，而HepG2和Huh7分别有2,871和3,036个DEGs。这些DEGs中包含多个与肝脏生理和毒理学响应相关的关键基因，如CYP2E1（乙醇和药物代谢）、SAA1（免疫反应）和RDH16（视黄醇代谢）等。

通路分析评估永生化细胞系的功能差异

通路富集分析显示，非HepaRG细胞系的DEGs显著富集于癌症、细胞周期和病毒相关通路，这与其癌源性或肝炎病毒感染背景一致。而HepaRG细胞系主要在与溶酶体和自噬过程相关的通路上存在差异，但在外源性代谢通路上与生理细胞更为接近，这解释了其在毒理学研究中表现优越的原因。

基因调控网络分析揭示肝细胞系中改变的亚网络和关键调控因子

通过Mergeomics进行的关键驱动分析（KDA）发现，在生理肝细胞与非生理细胞系的比较中，EEF1A1、DCXR、APOE、TPT1和PEBP1等基因是关键驱动因子（KDs），这些基因在代谢、毒物清除和癌症进展等核心生理过程中发挥重要作用。而在HepG2特异的DEGs网络中，CALM1被鉴定为关键驱动因子，其与癌症进展密切相关。

肝毒性案例研究表明HepaRG更好地保留了毒理学响应

为了验证基础转录组相似性是否转化为毒理学响应的相似性，研究人员分析了五种代表性毒物（对乙酰氨基酚、黄曲霉毒素B1、环孢素A、TCDD和WY-14643）暴露下的转录组响应。Fisher精确检验结果显示，在大多数情况下，HepaRG细胞系与生理参考签名（体内或原代肝细胞）的DEGs重叠度显著高于HepG2，表明HepaRG能更准确地模拟生理毒理学响应。

该研究的结论部分强调，基于转录组大数据的计算分析方法为体外细胞系选择提供了科学依据，能够有效识别生理相关性更高的模型。HepaRG细胞系在基础转录组和毒理学响应方面均表现出与生理肝细胞的高度相似性，是肝毒性研究的优选模型。而广泛使用的HepG2细胞系存在明显的转录组异质性和功能偏离，需谨慎使用。研究还指出，Hep3B和Huh7细胞系因其特定的病毒和癌症相关通路富集，更适合用于病毒性肝炎和肝癌研究。

这项研究的创新之处在于将计算生物学与毒理学研究相结合，利用现有大数据资源指导实验模型选择，为提高体外研究的生理相关性和转化价值提供了新思路。该方法可推广至其他组织类型的体外建模，对推动毒理学和生物医学研究具有重要意义。未来，结合3D培养技术和人源化小鼠模型将进一步优化体外毒性筛选平台，为药物开发和安全性评价提供更可靠的实验基础。