Th-1细胞因子预处理的角膜缘间充质干细胞小细胞外囊泡调控桥本甲状腺炎免疫炎症反应：一项离体概念验证研究

《Molecular Biomedicine》：Th-1 cytokine-primed small extracellular vesicles from limbal mesenchymal stem cells modulate immune and inflammatory responses in Hashimoto's Thyroiditis: an ex vivo proof-of-concept study

本研究针对桥本甲状腺炎(HT)免疫调节失衡的临床难题，创新性地探讨了Th-1细胞因子预处理的角膜缘间充质干细胞(f-LSCs)来源小细胞外囊泡(sEVs)的免疫调节潜能。研究通过切向流过滤(TFF)联合冻干技术成功保留sEVs生物活性，证实其可剂量依赖性地抑制效应T细胞增殖、促进调节性T细胞(Treg)扩增，并调控IDO1/PD-L1/IL-4等关键免疫因子表达。该发现为开发基于sEVs的细胞-free疗法治疗自身免疫病提供了新思路。

　　

在自身免疫疾病的治疗领域，桥本甲状腺炎(Hashimoto's Thyroiditis, HT)作为最常见的自身免疫性甲状腺疾病，一直面临着治疗手段有限的挑战。这种疾病以甲状腺内大量淋巴细胞浸润和调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)功能受损为特征，导致免疫系统对甲状腺组织发起错误攻击。当前，虽然维生素D、硒补充剂和JAK抑制剂等辅助疗法正在探索中，但如何有效恢复免疫耐受仍是治疗的关键瓶颈。

近年来，小细胞外囊泡(small extracellular vesicles, sEVs)——这些直径不超过200纳米的细胞分泌膜性颗粒，因其能够携带生物活性物质在细胞间传递信息，已成为炎症性疾病治疗的新希望。然而，sEVs的应用仍面临两大挑战：缺乏标准化的分离储存方案，以及sEVs是否能忠实传递其母细胞——间充质基质细胞(mesenchymal stromal cells, MSCs)的免疫调节功能尚不明确。

在这项发表于《Molecular Biomedicine》的研究中，Laura Tomasello及其团队将目光投向了角膜缘(limbus)这一免疫特权区域来源的特殊MSCs——角膜缘间充质干细胞(fibroblast limbal mesenchymal stem cells, f-LSCs)。研究团队在前期的研究中已经发现，经过Th-1细胞因子预处理的f-LSCs相比传统的骨髓来源MSCs，在HT患者中展现出更强的免疫抑制效果，这一作用与吲哚胺2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3 dioxygenase, IDO)和程序性死亡配体(programmed death ligand, PD-L)-1等关键分子的调控密切相关。

基于此，研究团队提出了一个关键科学问题：f-LSCs的免疫调节功能是否能通过其分泌的sEVs来传递？为了回答这个问题，他们开展了一项离体概念验证研究，旨在探讨Th-1细胞因子预处理的f-LSCs来源sEVs对HT患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)免疫反应的调节作用。

研究团队采用切向流过滤(tangential flow filtration, TFF)和化学沉淀(chemical precipitation, CP)两种方法分离sEVs，并通过一步冻干法进行保存。通过动态光散射(dynamic light scattering, DLS)、蛋白定量、Western blot和流式细胞术等多种技术对sEVs进行全面表征后，发现TFF法分离的sEVs在冻干后仍能保持良好的生物物理特性，且富含CD81、CD63和CD9等典型sEVs标志物。相比之下，CP法虽然产量较高，但sEVs的粒径分布更不均匀。

鉴于TFF法在仪器复杂度和操作成本上的优势，研究团队选择TFF法分离的sEVs进行后续功能实验。他们将sEVs与HT患者的活化PBMCs共培养，通过分析细胞周期分布、增殖/存活T细胞比例(Ki-67/Bcl-2双阳性细胞)和免疫抑制指数(immunosuppressive index, ISI)，发现Th-1细胞因子预处理的sEVs能够剂量依赖性地抑制T细胞扩增。具体而言，用20μg和80μg sEVs处理组中处于G2/S期的细胞比例分别为14.28±1.71%和9.03±1.04%，显著低于未处理组的27.39±1.63%。

更令人鼓舞的是，sEVs处理还促进了活性Treg细胞(CD4⁺CD25⁺/Foxp3⁺)的扩增。与未处理组相比，20μg和80μg sEVs处理组的Treg频率分别从3.88±0.80%上升至11.71±1.85%和15.44±0.71%。基因表达分析进一步显示，sEVs处理上调了IDO1、PD-L1和白细胞介素(interleukin, IL)-4的mRNA表达，同时下调了IL-2、IL-17、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractive protein, MCP)-1和异质核核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein, hnRNP)-A2/B1等促炎介质的表达。

通过对sEVs cargo(内容物)的分析，研究团队揭示了其发挥免疫调节作用的分子基础。Th-1细胞因子预处理显著增强了sEVs中多种免疫调节蛋白的含量，包括环氧化酶(cyclooxygenase, COX)-2(上调约1.4倍)、硫氧还蛋白(thioredoxin, TXN)-1(上调1.46倍)和PD-L1(上调1.38倍)。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP-70)在TFF和预处理sEVs中分别上调了2.08倍和3.13倍。这些分子共同构成了一個复杂的免疫调节网络，通过抑制炎症通路和促进免疫耐受来发挥治疗作用。

主要技术方法

本研究从HT患者和健康对照者获取外周血单核细胞(PBMCs)样本，采用切向流过滤(TFF)和化学沉淀(CP)两种方法分离f-LSCs来源的小细胞外囊泡(sEVs)，并通过冻干技术进行保存。通过动态光散射(DLS)、蛋白定量、Western blot和流式细胞术对sEVs进行表征。功能实验通过sEVs与活化PBMCs共培养，利用流式细胞术分析T细胞增殖和Treg细胞比例，采用qPCR检测免疫相关基因表达，并通过Western blot分析sEVs cargo中的关键蛋白。

sEVs的表征结果

通过比较TFF和CP两种分离方法，研究发现TFF法分离的sEVs在冻干后仍能保持良好的粒径分布(136.31±15.69 nm)和较低的分散指数(PDI: 0.38-0.45)，且富含CD81、CD63和CD9等典型sEVs标志物。Western blot证实冻干过程不会改变CD63和CD81等关键标志物的表达，表明TFF法结合冻干能有效保持sEVs的完整性和生物活性。

sEVs的免疫调节功能

功能实验表明，Th-1细胞因子预处理的sEVs能剂量依赖性地抑制HT患者来源活化PBMCs的T细胞增殖，20μg和80μg处理组的免疫抑制指数(ISI)分别为0.59±0.03和0.88±0.06。同时，sEVs处理显著促进了CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的扩增，从对照组的3.88±0.80%上升至处理组的11.71±1.85%(20μg)和15.44±0.71%(80μg)。

分子机制探讨

基因表达分析显示，sEVs处理上调了IDO1、PD-L1和IL-4的表达，同时下调了IL-2、IL-17、MCP-1和hnRNP-A2/B1等促炎因子。sEVs cargo分析进一步发现，Th-1预处理增强了COX-2、TXN-1、PD-L1和HSP-70等免疫调节蛋白的装载，这些分子可能通过协同作用调控T细胞功能并促进Treg细胞分化。

研究结论与意义

本研究首次证实了Th-1细胞因子预处理的f-LSCs来源sEVs具有强大的免疫调节功能，能够抑制效应T细胞增殖并促进Treg细胞扩增，在体外重现了母细胞的免疫调节特性。研究不仅为sEVs基于疗法治疗自身免疫疾病提供了概念验证，还创新性地建立了TFF结合冻干的sEVs制备方案，解决了sEVs保存的技术瓶颈。这些发现为开发针对桥本甲状腺炎等自身免疫疾病的细胞-free疗法奠定了坚实基础，尽管其长期疗效和体内效果仍需进一步验证。该研究通过精准调控免疫平衡，为自身免疫疾病的治疗开辟了新途径。