综述：肿瘤内微生物组：结直肠癌发生发展中的关键调控因素

《Molecular Biomedicine》：Intratumoral microbiome: a crucial regulating factor in development and progression of colorectal cancer

本综述系统阐述了肿瘤内微生物组在结直肠癌（CRC）中的核心作用。作者指出，利用单细胞和空间技术等先进方法，可解析微生物组的组成和功能。微生物通过诱导基因组不稳定性、慢性炎症和激活致癌通路促进CRC发生，并通过调节免疫微环境等机制推动进展。肿瘤内微生物组已成为诊断预后生物标志物的新来源，并通过微生物调控、工程菌等策略展示治疗潜力。本文为CRC精准医疗提供了新视角。

　　

工具与技术：解码肿瘤内微生物组的新利器

要解析肿瘤内微生物组的复杂性，需要一套精密的方法论体系。其最大挑战在于极低的微生物生物量淹没在 overwhelming 的宿主核酸背景中，这使得实验极易受到污染。因此，严格的实验控制和先进的生物信息学过滤成为可靠研究的基石。该领域已从单纯的种群普查，发展到通过整合多组学方法获得高分辨率、功能性和空间性的见解。

单细胞和空间技术为微生物的细胞定位提供了前所未有的视角。例如，INVADEseq等技术能够分离单个宿主细胞并检测胞内微生物，直接将特定细菌的定植与宿主细胞的转录组变化关联起来。而像DoTA-seq这样的微滴微流控平台，通过皮升级反应体积，实现了对复杂群落中单个微生物细胞遗传特征的高通量定量分析。空间转录组学技术（如10X Visium）则能在保留组织架构的同时，原位绘制微生物的空间分布图，揭示其在肿瘤缺氧、免疫富集区域的特异性富集模式。

高分辨率测序技术则致力于实现菌株水平的区分。长读长测序技术（如PacBio HiFi, Oxford Nanopore）能够对全长16S rRNA基因进行测序，提供了远高于短读长的系统发育分辨率，这对于识别诸如产colibactin大肠杆菌等特定病原体至关重要。先进的生物信息学工具（如MetaPhlAn4, mOTUs）进一步提升了重新分析现有数据集时的分辨能力。

多组学整合是通往功能洞察的必由之路。宏转录组学能识别原位主动转录的微生物途径；代谢组学（如LC-MS）可检测微生物代谢物并与宿主表型变化关联。通过机器学习整合这些数据，可以预测宿主-微生物的功能关系并识别潜在治疗靶点。最后，测序衍生的假说需要直接可视化验证。多重荧光原位杂交和D-丙氨酸标记等技术可在肿瘤切片中特异性地检测和定位活细菌，而透射电子显微镜仍是确认胞内细菌超微结构的金标准。

肿瘤发生发展的微生物驱动机制

借助这些先进方法，该领域已深入探究了肿瘤内微生物组的功能性后果。显然，这些微生物群落并非简单的“乘客”，而是癌症多阶段发病机制中的积极参与者。

肿瘤起始机制

微生物主要通过诱导DNA突变、引发慢性炎症和激活致癌通路这三种机制影响CRC的发生。

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  诱导基因组不稳定性：细菌外毒素是导致DNA损伤的关键因素。空肠弯曲菌产生的细胞致死膨胀毒素（CDT）能诱导细胞G₂/M期停滞和DNA双链断裂。脆弱拟杆菌产生的B. fragilis毒素（BFT）和具核梭杆菌产生的基因毒素-UshA等，均能通过引起DNA断裂或促进活性氧（ROS）产生，导致基因组不稳定，从而驱动肿瘤发生。pks⁺大肠杆菌甚至能影响DNA错配修复系统。
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  引发慢性炎症：慢性炎症是CRC发生的重要推手。微生物通过表观遗传修饰和与肠道菌群的相互作用介导这一过程。具核梭杆菌的表面蛋白FadA能与宿主E-钙黏蛋白结合，激活β-连环蛋白（β-catenin）信号，进而驱动白细胞介素（IL）-6等促炎细胞因子的表达，并可能诱导组蛋白修饰改变（如H3K27ac上调）。微生物代谢物也扮演关键角色：脆弱拟杆菌的BFT可诱导DNA高甲基化；微生物衍生的氧化三甲胺（TMAO）能抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶（SAHH），扰乱DNA甲基化模式；而短链脂肪酸（SCFAs）如丁酸盐，则是组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的有效抑制剂，可促进抗炎基因的转录。此外，微生物还能干扰microRNA（miRNA）表达谱，例如B. fragilis下调miR-149-3p，解除其对IL-17信号通路的抑制，加剧炎症。
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  激活致癌通路：肿瘤内微生物通过模式识别受体（PRRs）激活经典致癌通路。Toll样受体4（TLR4）能识别微生物脂多糖（LPS），通过髓样分化初级反应蛋白88（MYD88）触发AKT和核因子κB（NF-κB）通路。NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）可被病原体相关分子模式（PAMPs）激活，形成炎症小体，影响细胞增殖、PI3K/Akt和MAPK等通路，并通过影响ROS产生参与CRC发生。

肿瘤进展与转移机制

微生物通过调节关键信号通路和重塑肿瘤免疫微环境，推动肿瘤进展和转移。

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  调节致癌信号通路：
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    ROS信号通路：细菌毒素（如BFT）可增加上皮细胞和髓系细胞中的ROS水平，导致DNA氧化损伤和恶性转化，并促进上皮-间质转化（EMT）。
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    STAT3信号通路：微生物及其代谢物可通过PRRs下游信号异常激活信号转导和转录激活因子3（STAT3），影响细胞生长和免疫调节。
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    β-连环蛋白信号通路：沙门氏菌、具核梭杆菌等能激活Wnt/β-catenin通路。例如，具核梭杆菌的FadA通过结合E-钙黏蛋白稳定β-catenin，促进其核转位。
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    STING信号通路：微生物（如具核梭杆菌、乳酸杆菌）可产生STING激动剂，激活cGAS/STING依赖的I型干扰素（IFN-I）产生，促进树突状细胞（DC）活化和CD8⁺T细胞招募，增强抗肿瘤免疫。
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  重塑肿瘤免疫微环境：微生物通过多种方式精准调控免疫细胞。
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    T细胞与NK细胞：某些瘤内细菌能促进CD8⁺T细胞的招募和活化，从而增强抗肿瘤免疫应答。
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    B细胞与巨噬细胞：微生物表面抗原可被B细胞抗体受体识别，激活B细胞。同时，微生物相关分子模式（PAMPs）可通过TLRs等受体触发巨噬细胞极化。
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    调节趋化因子和白细胞介素：微生物可影响趋化因子（如CCL5, CXCL9/10）和白细胞介素（如IL-6, IL-2, IL-17）的表达，进而调控免疫细胞向肿瘤部位的募集和功能。

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  形成促转移生态位：微生物驱动的致癌信号和免疫抑制微环境共同 orchestrate 转移级联过程。在局部侵袭阶段，具核梭菌通过FadA激活β-catenin信号，增强肿瘤细胞侵袭性；产肠毒素脆弱拟杆菌通过BFT破坏上皮完整性，引发炎症，促进癌细胞 intravasation。在循环系统中，瘤内细菌可能与循环肿瘤细胞“共迁移”，并通过加固细胞骨架帮助其抵抗流体剪切力。在定植阶段，瘤内细菌通过抑制T细胞活性（如调节β-catenin信号）等方式，在远处器官形成适于肿瘤细胞定植的 pre-metastatic niche。在CRC肝转移中，甚至在转移灶中检测到与原发瘤匹配的具核梭杆菌，证实了其在转移过程中的直接作用。

诊断与预后生物标志物潜力

CRC肿瘤组织存在独特的微生物特征。与正常组织相比，CRC中具核梭杆菌、纤毛菌、弯曲菌等口腔致病菌的丰度显著增加，这为区分肿瘤与正常组织提供了分子基础。肿瘤内微生物组还具有重要的预后价值。例如，具核梭杆菌的富集与不良临床结局密切相关。研究将CRC瘤内微生物组分为三种致癌群落亚型（OCS），其中OCS1（以梭杆菌为主）和OCS3（以大肠杆菌、假单胞菌、志贺氏菌为主）与总生存期较差相关，而OCS2（富含厚壁菌门和拟杆菌门）则预后较好。值得注意的是，微生物的功能受其生态背景调控，例如，通常在肠道中有益的Faecalibacterium prausnitzii在特定菌群中可能预示较差预后，这凸显了群落水平分析的重要性。人工智能（AI）和机器学习在整合多组学数据、克服肿瘤异质性、构建稳健的诊断和预后模型方面展现出巨大潜力。

肿瘤内微生物组的靶向治疗

调节微生物组以增强常规疗法

瘤内微生物能显著调节化疗、放疗和免疫疗法的疗效。例如，具核梭杆菌可通过激活自噬通路导致化疗耐药，而某些γ-变形菌纲细菌能酶解吉西他滨和5-氟尿嘧啶（5-FU）等药物。相反，一些共生菌可通过调节ROS来增强奥沙利铂的疗效。在免疫治疗方面，具核梭杆菌在微卫星稳定（MSS）肿瘤中通常与免疫抑制微环境和免疫检查点抑制剂（ICIs）耐药相关，但在高度微卫星不稳定（MSI-H）肿瘤中，它可能通过刺激先天免疫信号和CD8⁺T细胞浸润而增敏抗PD-L1治疗。

战略干预：从清除到工程化

治疗策略正沿着三个方向演进：

1. 1.
   靶向清除有害细菌：为避免广谱抗生素引起的菌群失调，精准靶向策略正在开发。例如，脂质体包裹的抗生素复合物（LipoAgTNZ）能选择性清除小鼠CRC原发灶和转移灶中的具核梭杆菌，而不引起肠道菌群失调，并通过产生微生物新抗原激发抗肿瘤CD8⁺T细胞反应。
2. 2.
   利用内在抗肿瘤特性：某些瘤内细菌具有固有的生物相容性和免疫原性抗肿瘤特性。例如，AUN细菌联盟（包含奇异变形杆菌和沼泽红假单胞菌）能在多种小鼠肿瘤模型中特异性定植并诱导肿瘤裂解。微生物间的代谢互作也能激活宿主抗肿瘤通路，如厌氧消化链球菌和Faecalibacterium prausnitzii通过代谢交叉喂养激活宿主维生素D受体信号通路。
3. 3.
   工程菌：合成生物学使细菌成为 sophisticated 的治疗平台。沙门氏菌、大肠杆菌（如工程菌株EcN）、梭状芽孢杆菌和双歧杆菌等被设计为载体，通过复杂的合成基因电路（如感应低氧、高乳酸等肿瘤特征）实现肿瘤特异性靶向和药物控释。工程菌可作为原位生物工厂，持续产生和递送肿瘤抗原、免疫检查点抑制剂（如抗CD47纳米抗体）和细胞因子，将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤。未来，结合CRISPR基因编辑、多输入逻辑门电路和合成群体感应系统的下一代微生物疗法将更加智能化、个性化和高效化。

挑战与未来展望

肿瘤内微生物组的研究仍面临挑战，如其与肠道菌群的相互作用、低生物量下的高强度效应机制等均需深入探索。工程菌和细菌药物递送系统是极具前景的方向。AI将在解析复杂微生物数据、预测治疗反应、优化工程菌设计方面发挥关键作用。未来，通过管理或靶向微生物组，并结合免疫疗法和AI指导，有望实现更有效的肿瘤治疗。