足细胞表达中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的新发现：炎症分子模式调控机制及其在肾小球免疫中的作用

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Podocytes as novel sources of neutrophil serine proteases: expression and regulation by inflammatory molecular patterns

本研究针对传统认为中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）仅来源于造血细胞的认知局限，首次系统揭示了足细胞能够表达具有酶活性的NE、PR3和CG等NSPs及其抑制剂serpins，并证实其表达受PAMPs/DAMPs调控。研究人员通过体外实验证明炎症刺激可促使足细胞通过细胞外囊泡（EVs）释放活性NSPs和线粒体DNA，首次发现髓过氧化物酶（MPO）在足细胞中的表达重分布。该研究为理解足细胞主动参与肾小球免疫调控提供了新机制，对糖尿病肾病等肾小球疾病发病机制的认识具有重要突破意义。

　　

在肾脏的精密过滤系统中，足细胞作为肾小球滤过屏障的关键组成部分，长期以来主要被视为具有结构支持功能的高度分化上皮细胞。然而，越来越多的证据表明，这些细胞拥有令人惊讶的免疫细胞样特性。当病原体入侵或组织损伤发生时，中性粒细胞需要数小时才能到达肾小球并发挥防御作用，这一时间延迟可能造成防御空白期。特别值得注意的是，糖尿病患者由于免疫功能受损更易发生感染，而足细胞在血液过滤过程中直接接触病原体，这促使它们进化出快速应对威胁的能力。

传统观点认为，中性粒细胞丝氨酸蛋白酶（NSPs）——包括中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）、蛋白酶3（PR3）和组织蛋白酶G（CG）——是中性粒细胞的专属武器，这些酶类储存于中性粒细胞的嗜天青颗粒中，在免疫防御中发挥关键作用。但有趣的是，临床观察发现，在韦格纳肉芽肿患者的肾活检组织中，PR3和MPO出现在肾小管上皮细胞内，这暗示肾脏实质细胞可能存在我们尚未认知的蛋白酶表达和调控机制。

基于这些临床现象和科学问题，由Agnieszka Piwkowska领导的研究团队开展了一项创新性研究，旨在探索足细胞是否具备表达NSPs及其内源性抑制剂serpins的能力，并研究这些分子的表达如何受病原体相关分子模式（PAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）的调控。该研究发表于《Cellular and Molecular Molecular Sciences》杂志，为足细胞生物学领域带来了突破性见解。

研究团队运用了多种关键技术方法开展本研究。他们使用永生化人足细胞系（CIHP-1）和原代大鼠足细胞作为研究对象，通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光技术检测基因和蛋白表达；采用荧光底物法测定NE和PR3的酶活性；通过超速离心分离细胞外囊泡（EVs），并利用纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术表征EVs的粒径和浓度；使用透射电子显微镜（TEM）进行超微结构观察和免疫金标记；还通过MTT法和ApoTox-Glo三重检测法评估细胞活性和凋亡情况；此外，还构建了ELANE基因沉默的足细胞系，以研究NE在足细胞功能中的具体作用。

鉴定人和大鼠足细胞中NSPs的表达

研究人员首先在人和大鼠足细胞中检测到三种主要NSPs（CG、NE和PR3）的mRNA和蛋白表达。通过实时PCR扩增出特异性条带，免疫荧光染色显示这些蛋白酶主要分布于足细胞胞浆内，透射电镜金标技术进一步在亚细胞水平确认了NSPs的定位，主要见于内质网、线粒体和溶酶体等细胞器附近。

炎症分子模式调控中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的表达

为探究免疫刺激对NSPs表达的调控作用，研究团队用LPS（PAMP）、ATP和H₂O₂（DAMPs）以及PMA（PKC激活剂）处理足细胞。结果显示，ATP使hCTSG mRNA水平增加3倍，PMA和H₂O₂使其增加约2倍；ATP使hELANE mRNA增加2倍以上；PMA使hPRTN3 mRNA增加2倍。在蛋白水平，仅见PMA处理后hPR3蛋白水平轻微下降（12%），其他NSPs蛋白表达无显著变化，表明转录后调控机制可能参与NSPs的稳态维持。

鉴定NSPs抑制剂（serpins）及其受炎症分子模式的调控

研究证实足细胞表达三种serpins：SerpinE1、SerpinB1和SerpinA3。有趣的是，PMA刺激使SerpinE1 mRNA降低50%，而SerpinB1和SerpinA3 mRNA分别增加25%和惊人的46倍。在蛋白水平，PMA和H₂O₂分别使SerpinE1蛋白降低50%和30%，SerpinB1蛋白增加20%，SerpinA3蛋白无变化。这种mRNA与蛋白表达的不一致性提示存在复杂的转录后调控机制。

LPS、PMA、ATP和H₂O₂对氧化应激和细胞游离DNA释放的影响

炎症刺激显著增强足细胞氧化应激水平：LPS、PMA和ATP分别使ROS产量增加20%、50%和50%。NADPH氧化酶活性均增加约2倍。特别值得注意的是，PMA刺激使足细胞释放的细胞游离DNA（cfDNA）增加30%，其中线粒体DNA（mtDNA）增加3.5倍，核DNA增加50%，提示mtDNA可能作为重要的DAMP分子参与炎症放大效应。

足细胞释放具有酶活性的中性粒细胞丝氨酸蛋白酶

研究发现足细胞不仅表达NSPs，还能在炎症刺激下将其以活性形式释放到细胞外。LPS使细胞内NE活性增加40%，H₂O₂使其降低31%；细胞外环境中，PMA使NE活性增加2倍以上，H₂O₂使其增加60%；PMA使细胞外PR3活性增加60%，ATP使其降低19%。重要的是，PMA处理虽引起caspase-3/7活性增加38%和细胞活性降低20%，但未导致明显的细胞膜完整性破坏，表明NSPs释放不是细胞死亡的结果，而是主动分泌过程。

足细胞中髓过氧化物酶（MPO）的表达和活性鉴定

本研究首次报道了足细胞表达MPO的mRNA并具有酶活性。PMA刺激显著增加MPO表达，免疫荧光显示MPO定位于细胞颗粒结构中，且刺激后向细胞膜周边重新分布，提示足细胞可能存在类似免疫细胞的调节性分泌途径。

PMA增加EVs中NSPs的丰度

纳米颗粒跟踪分析显示，PMA刺激使足细胞分泌的EVs数量增加2倍，平均粒径基本不变（170nm vs 175nm）。Western blot和TEM证实，PMA处理的足细胞分泌的EVs中NE和PR3含量显著增加，提示EVs可能是足细胞传递活性蛋白酶的重要载体。

ELANE沉默影响细胞外囊泡释放

为明确NE在足细胞功能中的作用，研究人员构建了ELANE基因沉默的足细胞系（沉默效率达70%）。结果显示，NE沉默不仅降低基础条件下的EVs释放，还完全阻断了PMA诱导的EVs分泌增加，表明NE活性对足细胞囊泡分泌具有重要调控作用。

ELANE沉默降低NSPs活性、氧化应激并保护足细胞屏障功能和细胞骨架形态

功能实验表明，NE沉默显著降低基础和PMA刺激下的NE和PR3活性，抑制NADPH氧化酶活性和ROS产生。更重要的是，NE沉默足细胞在PMA刺激下保持更完整的滤过屏障功能（FITC-白蛋白通透性实验）和细胞骨架结构，直接证明NE参与介导足细胞损伤和屏障功能障碍。

本研究系统推翻了足细胞仅为结构细胞的传统认知，揭示其具有主动免疫应答能力。足细胞通过表达和分泌NSPs、serpins和MPO等免疫分子，以及通过EVs释放活性蛋白酶和mtDNA，可能成为肾小球炎症的发起者和调节者。这种新发现的机制为理解糖尿病肾病等肾小球疾病的发病机制提供了全新视角，特别是蛋白酶-抗蛋白酶平衡失调在足细胞损伤中的作用。未来研究需进一步阐明这些分子在活体肾脏疾病模型中的具体作用机制，以及它们作为潜在治疗靶点的可能性。该研究不仅重新定义了足细胞在肾脏免疫微环境中的角色，也为开发针对肾小球疾病的新治疗策略奠定了重要理论基础。