支持向量机用于识别小分子结合剂与SARS-CoV-2 Mpro中一个研究较少位的别构位点，为基于PROTAC的下一代疗法奠定基础

《Archiv der Pharmazie-Chemistry in Life Sciences》：Support Vector Machine Identification of Small Molecule Binders to an Understudied Allosteric Site of SARS-CoV-2 Mpro for Next-Generation PROTAC-Based Therapeutics

基于机器学习的虚拟筛选结合微尺度热迁移实验，鉴定出三个与SARS-CoV-2 Mpro辅助位点结合的化合物（Kd值2.8±0.9 μM），但未抑制酶活性，提示非竞争性结合。通过分子对接和动态模拟确认辅助位点，为PROTAC设计提供新靶点。

　　
SARS-CoV-2 Mpro（主蛋白酶）作为病毒复制的关键酶，自2020年新冠疫情暴发以来便成为全球药物研发的焦点。Mpro的催化活性依赖于Cys145和His41形成的独特二硫键桥，这种非典型活性位点使其区别于其他蛋白酶家族，成为开发选择性抑制剂的重要靶点。2022年FDA批准的Paxlovid组合疗法，正是基于nirmatrelvir通过共价结合Cys145实现的高效抑制，这为后续研究确立了技术路线。然而，共价抑制剂存在药物代谢稳定性差、半衰期短等问题，非共价抑制剂的开发因此备受关注。

研究团队首先建立了基于支持向量机（SVM）的机器学习模型，通过分析超过两万种小分子的物理化学特性，筛选出180个候选化合物。这种数据驱动的方法突破了传统药效团筛选的局限，特别适用于结构复杂、作用机制不明确的靶点。微尺度热迁移（MST）实验进一步验证了候选物的结合能力，其中化合物7展现出2.8±0.9 μM的纳摩尔级结合亲和力，远超其他候选物。值得注意的是，所有高亲和力化合物在酶活性抑制实验中均未显示显著效果，这提示着非经典的作用模式。

通过分子动力学（MD）模拟和结构对接分析，研究团队揭示了Mpro蛋白表面存在两个新的辅助结合位点（Site1和Site2）。这两个位点位于催化活性中心的对侧，与Domain II和Domain III的交界区域形成稳定口袋。计算机模拟显示，化合物7通过π-π堆积与Phe294形成关键相互作用，同时依托Leu253、Pro293等残基构建的疏水腔体实现稳定结合。这种远离活性中心的结合方式，解释了为何实验中未观察到酶活性抑制——化合物并未干扰Cys145-His41催化的关键步骤。

结构生物学研究证实，Site1与Site2虽具有结合能力，但其与催化活性中心的物理分隔使得它们可能通过调节蛋白构象发挥间接作用。AT7519这种已知化合物在Site1的结合虽能引发Asp153与Arg298的构象变化，但其临床前抗病毒活性仅达微摩尔级别，暗示辅助位点可能更适合开发新型靶向蛋白降解剂（PROTACs）。PROTACs通过连接酶和配体形成三聚体，诱导蛋白酶体降解靶蛋白，这种机制理论上可突破传统抑制剂对代谢的依赖，降低耐药风险。

研究团队创新性地将机器学习筛选、结构生物学验证和PROTAC设计整合，提出化合物7作为PROTAC的骨架核心。通过计算化学分析，他们建议在苯环的间位引入碘代或溴代基团，利用Sonogashira偶联反应构建PROTAC分子。这种设计策略不仅保留了高亲和力的苯并异噁唑啉酮结构特征，还通过刚性连接器增强与E3泛素连接酶的结合稳定性。经济性评估显示，溴代策略在成本（$44/100g）和产率（49%）方面更具优势，这为后续规模化生产提供了可行路径。

该研究突破传统抑制剂研发逻辑，开创了"非活性位点结合-构象调控-蛋白降解"的三阶段开发模式。特别是通过SiteMap算法发现的辅助结合位点，为开发新型抗病毒药物提供了结构基础。这种将计算预测与实验验证相结合的方法，不仅加速了药物研发进程，更重要的是揭示了蛋白酶辅助位点的潜在价值——通过靶向这些非关键但稳定的结合区域，可能实现更精准的蛋白降解治疗，这对克服现有药物耐药性问题具有重要启示。

当前研究仍存在待解难题：首先，辅助位点结合的生理意义尚未明确，需通过体外酶动力学实验验证构象变化的定量关系；其次，PROTACs的体内稳定性与免疫原性仍需优化，特别是连接臂的柔性设计对循环半衰期的影响值得深入研究；最后，如何将体外高亲和力转化为体内有效浓度，需要进一步药代动力学考察。这些挑战为后续研究指明了方向，尤其是结合冷冻电镜技术解析PROTACs与Mpro的动态结合模式，可能为优化分子设计提供关键参数。

该成果的意义在于建立了从虚拟筛选到PROTAC设计的完整技术链条，其核心贡献在于：（1）首次系统揭示了Mpro的辅助结合位点；（2）创新性地将SVM模型与MST实验结合，突破传统抑制剂筛选瓶颈；（3）提出基于现有化合物的PROTAC设计范式，为同类研究提供方法论参考。这些进展不仅推动了抗COVID-19药物研发，更为其他膜蛋白靶点的PROTAC开发奠定了基础，特别是在耐药性病毒株的持续威胁下，这类靶向蛋白降解的新疗法显示出广阔的应用前景。