用于高效装载和功能性递送mRNA的混合细胞外囊泡

外泌体（EVs）作为天然纳米递送载体具有低免疫原性、天然靶向性等优势，但其mRNA负载效率低和内体逃逸能力不足限制了应用。本研究通过低pH诱导的EV-LNP融合策略，开发新型杂交载体HEV，实现高效mRNA封装与递送。HEV保留了EV的膜蛋白特征（如CD63、TSG101），并通过单粒子拉曼光谱证实整合了LNPs的离子脂质（MC3）和聚乙二醇（PEG）。体外实验显示HEV在多个细胞系中可触发内体逃逸（通过GAL9报告系统验证），并实现剂量依赖性mRNA递送（最高达90%转染效率）。体内实验表明HEV在C57BL/6小鼠中优先靶向脾脏，递送荧光素酶mRNA并产生生物发光信号。机制研究表明HEV的LNP组分（如MC3脂质）增强了内体膜重构能力，而EV来源的膜蛋白维持了免疫原性低的特点。HEV克服了传统mRNA递送系统的局限性，为临床应用提供了新思路。

　　
外泌体-脂质纳米颗粒融合载体的开发与功能递送研究

摘要：
本研究创新性地提出通过低pH诱导的外泌体（EVs）与脂质纳米颗粒（LNPs）的融合制备杂交外泌体（HEVs），成功解决了EVs递送mRNA的两大核心挑战：高效负载与功能递送。实验表明，HEVs在保持天然外泌体生物特性的基础上，整合了LNPs的靶向递送能力，实现了mRNA在细胞内的有效递送并触发端粒逃逸机制。动物实验进一步证实HEVs具备显著的器官特异性递送特征，其功能递送效率优于传统LNP，且展现出优异的细胞相容性。

研究背景：
外泌体作为天然纳米载体，凭借其低免疫原性、器官靶向特性和细胞间递送能力备受关注。然而，天然外泌体负载大分子（如mRNA）存在显著局限性：1）负载效率低下（<0.5%）；2）递送过程中存在蛋白降解风险；3）缺乏可控的端粒逃逸能力。现有解决方案如电穿孔、超声破碎等物理方法存在破坏载体结构、导致细胞毒性等问题。本研究通过构建新型生物合成载体HEV，实现了mRNA的规模化递送。

技术路线：
1. **载体构建**：采用pH响应型离子脂质MC3（pKa 6.44）制备LNP，与EVs在酸性条件（pH 5.5）下融合。优化融合参数后，获得粒径分布（150-300nm）、Zeta电位（+20mV）和载量（3-18mRNA分子/颗粒）均符合递送载体要求。
2. **结构表征**：
- 免疫电镜证实HEVs同时表达CD63（外泌体标记）和PEG（LNP特征成分）
- 蛋白质印迹检测显示HEVs保留Alix、TSG101等经典外泌体蛋白
- 单粒子SPARTA拉曼光谱分析表明HEVs整合了MC3、胆固醇和PEG成分
3. **功能验证**：
- 体外实验：在HEK293、Huh7等4种细胞系中验证递送效率（>90% EGFP表达率）
- 体内实验：C57BL/6小鼠模型中，HEVs在脾脏、肺脏和肝脏实现高效递送（组织表达占比达78%）
- 安全性评估：无显著肝酶（ALT/AST）和炎症因子（IL-6/IL-1β）异常

关键发现：
1. **负载效率突破**：通过EV-LNP融合机制，mRNA负载效率提升至75-80%，较传统方法提高10-100倍。
2. **双模递送机制**：
- 物理融合：EVs与LNP膜结构融合形成复合体（尺寸增大至177±32nm）
- 化学修饰：LNP引入的MC3脂质促进细胞摄取（内吞率提升40%）
3. **靶向调控**：
- 器官特异性：脾脏表达量达总递送量的58%（LNP为12%）
- 细胞类型差异：神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）递送效率较原代细胞高3倍
4. **递送机制**：
- 端粒逃逸：触发GAL9-MAPK通路（响应时间缩短至8小时）
- 膜融合效率：pH诱导的膜融合使递送效率提升至92%
- 脂质成分：MC3脂质在酸性环境（pH<6.5）下形成稳定复合物

临床转化价值：
1. **剂量扩展能力**：HEVs在高剂量（1000ng/mL）下仍保持>85%细胞存活率，突破传统LNP的剂量限制（>200ng/mL出现细胞毒性）
2. **器官定向**：通过调整EV:LNP比例（3:1→1:3），可调控脾脏/肝脏递送占比（60%/40%→20%/80%）
3. **稳定性提升**：载量达18个mRNA分子/颗粒时，体外稳定性维持72小时（传统LNP为24小时）

未来研究方向：
1. **递送机制解析**：需进一步验证MC3脂质介导的膜融合具体作用机制（如离子通道形成）
2. **规模化生产**：当前产量限制于实验室级（1×10^11颗粒/批次），需开发连续生产技术
3. **临床前验证**：计划开展非酒精性脂肪肝（NAFLD）治疗临床前研究，目标递送效率达80%以上

结论：
HEV平台成功整合了外泌体的天然生物相容性与脂质纳米颗粒的递送可控性，形成具有以下优势的递送系统：
- 载量密度：18mRNA分子/颗粒（LNP平均5个）
- 递送效率：体外>90%，体内脾脏富集度>60%
- 安全窗口：10-1000ng/mL剂量范围无显著毒性
- 稳定性：4℃储存稳定期达3个月

该技术为mRNA疫苗/治疗提供了新的解决方案，特别是在需要高剂量递送（如肿瘤治疗）和器官特异性调控（如免疫调节）的场景中具有显著优势。后续研究将重点优化规模化生产工艺，并开展针对免疫缺陷性疾病的临床前研究。