伴侣动物中出现的毛滴虫感染：利用RPA-CRISPR/Cas12a检测方法快速可视化识别Pentatrichomonas hominis和Tritrichomonas foetus

Pentatrichomonas hominis和Tritrichomonas foetus是常见的人畜共患病原体，分别引起慢性腹泻和胃肠道疾病。本研究开发了基于重组酶聚合酶扩增（RPA）和CRISPR/Cas12a的快速检测方法，结合侧流试纸（LFS），可在37℃下40分钟内实现双物种特异性检测，灵敏度达50拷贝/μL，特异性高于其他常见寄生虫。临床验证显示，在48只犬和22只猫的粪便样本中，该方法与PCR检测结果完全一致，为兽医和资源有限地区的诊断提供了高效工具。

　　
本文聚焦于开发一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术的快速检测方法，用于鉴定犬类和猫科动物粪便样本中的人兽共患病原虫——Pentatrichomonas hominis（P. hominis）和Tritrichomonas foetus（T. foetus）。该方法通过结合等温扩增技术、CRISPR-Cas12a的核酸特异性检测以及侧流试纸条（LFS）的视觉化读数，实现了高灵敏度与快速检测的突破，为兽医临床及资源有限地区的疾病防控提供了新工具。

### 关键发现与技术创新
1. **双试剂同步检测系统**
研究团队构建了两种检测方案：一种是同时检测P. hominis和T. foetus的双试剂系统，另一种是针对P. hominis的单一试剂系统。双试剂系统通过靶向两种原虫共有的18S rRNA基因保守区域，结合特异性crRNA设计，实现了40分钟内完成样本处理至结果判读的全流程。例如，在48份犬类粪便样本中，29.2%的样本被检测出P. hominis感染；而在22份猫科样本中，36.4%的样本携带T. foetus。通过优化RPA扩增条件（如42℃反应20分钟），检测灵敏度达到50 DNA拷贝/μL，且对其他常见寄生虫（如隐孢子虫、贾第鞭毛虫等）无交叉反应。

2. **CRISPR-Cas12a与LFS的协同应用**
该方法创新性地将RPA扩增与CRISPR-Cas12a的核酸酶活性检测相结合。Cas12a在识别目标DNA后，会切割探针中的荧光淬灭基团，释放荧光信号。通过设计带有生物素和荧光标记的探针，结合侧流试纸条的C线（捕获线）和T线（检测线），实现了可视化结果的即时判读。例如，当探针浓度为100 nM时，T线信号清晰可见，而浓度过高（如1 μM）会导致信号假阳性。

3. **临床验证的准确性**
在70份临床样本的测试中，双试剂系统与 nested PCR的结果完全一致（100%符合率）。针对P. hominis的单一试剂系统，灵敏度进一步降至20拷贝/μL，且特异性验证显示其能有效区分目标病原与其他7种非靶标寄生虫（如犬弓首蛔虫、隐孢子虫等）。此外，通过优化RPA引物组合（如F1/R6对），确保扩增产物在2%琼脂糖凝胶中清晰可见，验证了方法的可靠性。

### 技术优势与局限性分析
**优势方面**：
- **操作简化**：无需昂贵的热循环仪或荧光检测设备，仅需恒温孵育（如37℃或42℃）和肉眼判读试纸条结果。
- **时间效率**：总检测时间从传统PCR的数小时缩短至40分钟，适合现场筛查和批量样本处理。
- **成本控制**：试剂复用性高，且无需专业培训即可操作，尤其适用于基层兽医机构或偏远地区。
- **多重检测能力**：双试剂系统可同时识别两种原虫，解决临床中常见的混合感染诊断难题。

**局限性及改进方向**：
- **样本前处理繁琐**：DNA提取步骤（如蛋白酶K消化、硅胶膜纯化）耗时较长，且需避免污染，可能影响整体效率。
- **试剂依赖性**：当前使用的RPA试剂盒和定制试纸条成本较高，限制大规模推广。建议未来开发标准化试剂包。
- **温度敏感性**：实验显示最佳扩增温度为42℃，但实际应用中可能面临温控设备不足的问题，需探索常温或室温可行性。
- **低丰度检测挑战**：虽然灵敏度达50拷贝/μL，但针对极低载量样本（如<10拷贝/μL）的检测性能仍需验证。可尝试结合预富集技术或纳米孔测序辅助。

### 疾病防控与公共卫生意义
P. hominis与人类慢性腹泻的关联性已被多项研究证实，而T. foetus在猫科动物中的高传播性（尤其在猫舍和驯养场）可能引发大规模肠道疾病暴发。传统检测依赖显微镜观察或PCR，前者易受样本处理质量影响，后者则需专业实验室支持。新方法的临床转化潜力显著：
- **兽医领域**：可快速筛查犬猫肠道原虫感染，指导抗生素选择（如P. hominis对甲硝唑敏感，而T. foetus可能对其他药物响应），减少误诊。
- **公共卫生**：通过检测宠物携带的T. foetus，可阻断人畜共患病传播链；对P. hominis的流行病学调查有助于揭示其在人类免疫缺陷群体中的致病机制。
- **资源适配性**：无需电力或复杂设备，适合非洲、东南亚等地区基层诊所的部署，助力WHO消除热带病行动。

### 方法学对比与适用场景
当前市场已有的快速检测试剂盒（如胶体金法）通常灵敏度较低（约1000拷贝/μL），且无法区分P. hominis与T. foetus。而CRISPR-Cas12a技术通过“分子剪刀”机制实现精准检测，结合RPA的等温扩增特性，在保持高灵敏度的同时大幅缩短时间。例如，传统PCR需2小时以上，而本方法在30分钟内即可完成RPA扩增和CRISPR信号释放。此外，试纸条设计可扩展至多联检（如同时检测蛔虫、钩虫等），为未来开发复合检测平台奠定基础。

### 结论与展望
本研究证实了RPA-CRISPR-Cas12a-LFS技术对P. hominis和T. foetus的高效检测能力，其临床应用价值已通过样本验证。未来需重点突破两点：一是优化前处理流程（如开发自动化DNA提取设备），二是降低试剂成本。此外，可探索该方法与其他技术（如微流控芯片）的整合，进一步提升检测通量和自动化水平。该技术的成功为其他原虫（如蛔虫、滴虫）的快速诊断提供了可复用的技术框架，对全球寄生虫病防控具有借鉴意义。