完全由诱导多能干细胞衍生的人类血脑屏障三维模型用于探索神经血管疾病机制和治疗干预

《Nature Neuroscience》：A fully iPS-cell-derived 3D model of the human blood–brain barrier for exploring neurovascular disease mechanisms and therapeutic interventions

　　

血脑屏障（BBB）的完整性对于脑稳态至关重要，其功能障碍与神经血管和神经退行性疾病相关。关于BBB功能的机制研究主要基于啮齿动物和体外模型，这些模型虽能重现部分疾病特征，但向人类的转化能力有限，且给药物发现带来挑战。本研究报道了一种完全由人类诱导多能干细胞（iPS）衍生、基于微流控的三维（3D）BBB模型，包含内皮细胞（ECs）、壁细胞和星形胶质细胞。该模型表达典型的命运标志，在血管样管中形成屏障，并支持灌注，包括人血。在ECs中缺失FOXF2（脑小血管病的主要风险基因）会诱导BBB功能障碍的关键特征，包括细胞连接完整性受损和小窝形成增强。蛋白质组学分析揭示内吞作用和细胞连接通路失调。这些疾病特征与ECs特异性Foxf2缺陷小鼠中观察到的表型一致。此外，基于脂质纳米颗粒（LNP）的Foxf2 mRNA治疗可挽救BBB缺陷，显示了药物开发的潜力。

论文解读文章

研究背景与问题：血脑屏障（BBB）的完整性对中枢神经系统稳态至关重要，其功能障碍在神经血管疾病（如脑小血管病）和神经退行性疾病中起关键作用。既往对BBB功能的研究主要依赖啮齿动物模型和简化二维（2D）体外培养系统，这些模型虽能部分模拟疾病特征，但存在种属差异和结构简化问题，限制了向人类临床转化的能力。动物模型与人类在遗传和分子水平上的差异被认为是神经疾病临床试验失败的原因之一。因此，亟需开发能复现人类BBB核心特征及其功能障碍的体外模型。近年来，诱导多能干细胞（iPS）技术和分化方案已能生成BBB相关细胞类型，但现有模型多为半透膜共培养或基于二维系统，缺乏三维（3D）血管样结构和完全同基因背景。基于此，研究人员旨在构建一个完全由iPS细胞衍生的、包含所有主要BBB细胞类型的3D微流控模型，用于研究神经血管疾病机制并测试治疗干预。

研究内容与结论：研究人员通过优化分化方案，从人类iPS细胞系（Thermo Fisher Scientific, A18945）高效生成内皮细胞（iECs）、周细胞（iPCs）、平滑肌细胞（iSMCs）和星形胶质细胞（iASs），并通过蛋白质组学、转录组学与人类原代细胞和已发表体内数据集对比验证了其细胞身份和功能。将这些细胞在微流控芯片中与纤维蛋白水凝胶共培养，iECs自组织形成具有正确顶底极性、紧密连接、胞外基质分泌和可灌注管腔的血管样结构，成功构建了完全由iPS细胞衍生的3D BBB模型。利用CRISPR–Cas9基因编辑技术，研究人员在iPS细胞中敲除FOXF2（脑小血管病风险基因），分化后获得FOXF2缺陷iECs，并在3D模型中观察到小窝蛋白（CAV1）上调、紧密连接蛋白（TJP1）下调、内吞摄取增加和跨内皮电阻（TEER）降低等BBB功能障碍特征，这些表型与同时构建的ECs特异性Foxf2条件敲除小鼠（Foxf2^iECKO）脑微血管中观察到的结果一致。蛋白质组学分析显示内吞和细胞黏附通路失调，染色质免疫沉淀测序（ChIP–seq）提示FOXF2直接调控CAV1和TJP1。最后，研究人员利用脂质纳米颗粒（LNP）递送Foxf2 mRNA，成功部分恢复了FOXF2缺陷3D培养物中CAV1和TJP1的蛋白水平，并减少了内吞摄取，展示了该模型在药物开发中的潜力。该研究发表于《Nature Neuroscience》。

主要关键的技术方法（不超过250字）：
研究使用了以下关键技术：① **iPS细胞分化**：通过中胚层诱导和血管特化方案分别生成iECs、iPCs、iSMCs（含CDH5磁珠分选），通过神经前体细胞诱导和无血清胶质分化获得iASs。② **基因组编辑**：采用CRISPR–Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物电穿孔敲除FOXF2（靶向外显子DNA结合区），获得两个独立敲除克隆并验证无脱靶。③ **3D微流控模型**：将iECs、iASs与iPCs或iSMCs混合于含凝血酶的纤维蛋白原溶液中，注入微流控芯片（AIM Biotech）凝胶通道，通过重力驱动灌注培养。④ **多组学分析**：采用非标记定量液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学、批量RNA测序和ChIP–seq。⑤ **功能检测**：跨内皮电阻（TEER）测量、荧光示踪剂（不同分子量葡聚糖）渗漏实验、内吞标记（FM1-43FX、霍乱毒素B亚基CTB）检测。⑥ **动物模型**：利用Cdh5-CreERT2; Foxf2^fl/fl小鼠（Foxf2^iECKO）实现成年脑EC特异性基因缺失（他莫昔芬诱导）。原代人类细胞（脑微血管ECs、周细胞、SMCs、星形胶质细胞）购自ScienceCell，用于比较验证。

研究结果：

**分化神经血管细胞类型及蛋白质组学表征**：研究人员建立了从iPS细胞分化iECs、iPCs、iSMCs和iASs的方案，各细胞类型均高表达相应命运标志（如iECs表达PECAM1、CDH5、CLDN5；iPCs表达ANPEP、CD248；iSMCs表达SMA；iASs表达GFAP、S100B），且不表达上皮标记。无监督主成分分析（PCA）显示iECs与脑微血管内皮细胞系hCMEC聚类，iPCs/iSMCs与原代壁细胞接近，iASs与原代星形胶质细胞聚类。与人类原代细胞及已发表的在体血管蛋白质组数据集（来自refs.31,32）比较，iPS衍生细胞的细胞特异性标志表达水平与体内数据高度相似。功能检测证实iECs表达功能性ABC转运蛋白（PGP、MRP1、BCRP1）并具有跨内皮电阻（TEER约70–100 Ω·cm²），共培养可进一步提高转运活性和TEER。

**完全iPS衍生人类3D BBB模型的表征**：iECs与iASs及iPCs或iSMCs在微流控芯片中共培养3天后，iECs自组织形成分支血管样管腔，表达TJP1和CLDN5紧密连接蛋白，电镜显示相邻细胞间电子致密区域。管腔可灌注10-kDa和40-kDa葡聚糖及人血而不渗漏。iECs表现出顶底极性（podocalyxin朝向腔侧，胶原IV朝向基底侧），钙离子成像显示缓变钙波。与单培养相比，共培养显著增加TJP1和胶原IV表达，提高分支复杂度，且周细胞相关血管直径小于平滑肌细胞相关血管。肿瘤坏死因子（TNF）刺激可诱导E-selectin和ICAM-1上调，模拟炎症表型。

**FOXF2缺陷在3D BBB模型中失调小窝和细胞连接并在体内表型复制**：在人类iPS细胞中敲除FOXF2后，分化所得FOXF2^KO iECs在3D模型中显示CAV1蛋白上调（免疫荧光和透射电镜确认小窝增多），TJP1蛋白下调，而同时构建的Foxf2^iECKO小鼠脑微血管中同样观察到CAV1上调、TJP1下调以及内皮增厚和囊泡富集，表型完全一致。

**FOXF2缺陷iECs中广泛的屏障和细胞运输缺陷**：FOXF2^KO iECs的蛋白质组学鉴定出2,839个显著改变蛋白，基因本体（GO）富集分析显示“囊泡介导运输”、“黏着斑组装”和“血管通透性调节”受影响最大。上调蛋白包括小窝组装调节因子CAV1、PACSIN2及网格蛋白包被囊泡成分；下调蛋白包括紧密连接复合物CDH5、CLDN5、TJP1及整合素介导黏附蛋白。功能实验显示FOXF2^KO iECs内吞摄取（FM1-43FX和CTB）增加，TEER降低，紧密连接转录本（TJP1, CLDN5, OCLN）下调，3D血管网络分支减少且管径增大，对大分子量葡聚糖通透性增加。ChIP–seq分析发现FOXF2直接结合CAV1和TJP1基因座，提示其直接调控。

**LNP递送FOXF2体外恢复BBB缺陷**：利用LNP包裹Foxf2 mRNA经管腔灌注至FOXF2缺陷3D培养物，24小时后qPCR确认外源Foxf2 mRNA表达，免疫荧光显示CAV1蛋白水平下调至接近野生型（WT），TJP1蛋白上调，且FM1-43FX内吞摄取减少，功能性缺陷得到部分拯救。

总结讨论与研究结论：
讨论部分指出，本研究开发的完全iPS细胞衍生3D BBB模型克服了既往模型缺少完全同基因背景或混合使用原代细胞的局限。多层面验证表明iPS衍生细胞具有明确的BBB细胞身份，其中iECs更接近脑内皮而非其他内皮或上皮。原代ECs在表达和功能上表现不如hCMEC和HUVEC，提示其可能不能准确反映体内状态。壁细胞（周细胞与平滑肌细胞）仍存在身份定义的挑战，两者在蛋白质组表达上高度相似，这与体内沿血管树异质性分布及缺乏特异性标志物有关。研究利用FOXF2缺陷模型证实了内皮自发性FOXF2缺失足以导致BBB功能障碍，且表型在体内小鼠模型中得到复核，凸显了模型的疾病机制研究价值。蛋白质组学和ChIP–seq数据支持FOXF2直接调控TJP1和CAV1从而维持内皮稳定性。LNP递送实验表明mRNA治疗可逆转FOXF2缺失引起的分子和功能缺陷，证明了模型在药物递送测试中的适用性。目前模型存在局限性：缺乏恒定生理流动以施加剪切应力、无法实时测量TEER、微流控芯片尺寸限制组学分析、仅研究了ECs中的FOXF2缺失而未涉及壁细胞，且未来需整合更多细胞类型（如小胶质细胞、神经元、单核细胞）以全面模拟BBB复杂性。

研究结论：
本研究建立了一个完全由人类iPS细胞衍生的、包含所有主要细胞类型的3D微流控BBB模型，该模型能重现BBB的关键形态和功能特征。通过内皮细胞特异性FOXF2缺失，该模型成功再现了脑小血管病相关BBB功能障碍（包括小窝形成增加、紧密连接破坏和通透性升高），并在体内FOXF2条件敲除小鼠中得到验证。蛋白质组学揭示FOXF2调控内吞和细胞黏附通路，ChIP–seq提示其直接靶向CAV1和TJP1。LNP介导的Foxf2 mRNA递送能够部分挽救这些缺陷，表明该模型可用于探索神经血管疾病机制及评估内皮靶向治疗策略。