生物钟紊乱通过激活RIPK1-RIPK3-MLKL轴加剧小鼠非酒精性脂肪性肝病的机制研究

《Scientific Reports》：Circadian disruption aggravates non-alcoholic fatty liver disease by activating RIPK1-RIPK3-MLKL axis in mice

本研究聚焦于生物钟紊乱（CCD）加剧非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的机制难题。研究人员通过建立高脂饮食联合昼夜节律干扰的小鼠模型，发现CCD通过激活RIPK1-RIPK3-MLKL信号通路，诱导肝脏库普弗细胞（KCs）发生坏死性凋亡（necroptosis），从而加剧NAFLD小鼠的肝脂肪变性、肝功能损伤及纤维化进程。该研究为揭示CCD促进NAFLD进展的新机制提供了实验依据，并为靶向干预提供了潜在新靶点。

　　

在现代社会，随着轮班工作、熬夜等生活方式的普及，人体的生物钟——这个负责调节我们睡眠、饮食、代谢等生理过程近24小时周期性节律的内在系统——正面临着前所未有的挑战。与此同时，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）已成为全球最常见的慢性肝病，其特征是肝脏中过度脂肪堆积，而非由过量饮酒引起。NAFLD与肥胖、2型糖尿病等代谢综合征密切相关，严重时可进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。目前，尚无针对NAFLD的特效药物获批，生活方式干预仍是主要手段。越来越多的流行病学和实验研究证据表明，生物钟紊乱是NAFLD发生和发展的一个重要风险因素。然而，生物钟紊乱究竟通过何种分子机制加剧NAFLD的进展，这一科学问题尚未被完全阐明。

为了回答这一问题，来自南昌大学第一附属医院和江西省儿童医院的研究团队在《Scientific Reports》上发表了一项研究。他们旨在探究生物钟紊乱对NAFLD小鼠模型的影响，并深入探索其背后的分子通路，特别是关注了一种程序性细胞死亡方式——坏死性凋亡（necroptosis）及其在肝脏固有免疫细胞（库普弗细胞）中的作用。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下关键技术方法：他们使用了40只SPF级雄性C57BL/6J小鼠，通过为期12周的高脂饮食喂养建立NAFLD模型，并同步实施昼夜节律干扰干预（通过周期性颠倒光照周期模拟生物钟紊乱）。实验设置了对照组、NAFLD模型组、单纯生物钟紊乱组（CCD）以及NAFLD合并生物钟紊乱组（NAFLD+CCD）。研究通过生化试剂盒检测血清和肝脏组织的脂质水平（TC, TG, LDL-C, HDL-C）及肝功能指标（ALT, AST）；采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清炎症因子（TNF-α, IL-6）水平；利用苏木精-伊红（HE）染色、Masson染色和天狼星红（Sirius Red）染色观察肝脏组织病理学变化和胶原纤维沉积；通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测肝细胞凋亡；运用免疫组织化学法分析纤维化相关蛋白（胶原IV（Collagen IV）、纤连蛋白（Fibronectin）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA））的表达；采用蛋白质印迹法（Western Blotting）评估坏死性凋亡关键蛋白（磷酸化RIPK1（p-RIPK1）/RIPK1、磷酸化RIPK3（p-RIPK3）/RIPK3、磷酸化MLKL（p-MLKL）/MLKL）的表达水平；并创新性地使用免疫荧光三重染色技术观察RIPK1与巨噬细胞标志物IBA1以及库普弗细胞（KCs）特异性标志物Clec4F的共定位情况。

研究结果

Circadian disruption exacerbates lipid accumulation and impairs liver function in mice with NAFLD. （生物钟紊乱加剧NAFLD小鼠的脂质蓄积和肝功能损伤）

研究结果显示，与对照组相比，NAFLD组和单纯CCD组小鼠的肝体比、血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）以及肝脏TG含量均显著升高，而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平降低。更重要的是，在NAFLD小鼠基础上施加CCD干预（NAFLD+CCD组），这些脂质代谢异常指标进一步恶化。同时，NAFLD+CCD组小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平也显著高于NAFLD组，表明CCD加重了NAFLD相关的肝功能损害。

Effect of circadian disruption on the hepatic histopathological structure in NAFLD Mice. （生物钟紊乱对NAFLD小鼠肝脏组织病理结构的影响）

肝脏组织病理学分析结果更为直观。HE染色显示，NAFLD+CCD组小鼠的肝脏脂肪变性（肝细胞内脂滴积聚）和炎症细胞浸润程度比NAFLD组更严重。Masson染色和天狼星红染色则共同揭示，NAFLD组和CCD组小鼠肝脏中已有少量胶原纤维沉积，而NAFLD+CCD组的胶原纤维沉积量显著增加，提示CCD促进了NAFLD向肝纤维化的进展。

Circadian disruption aggravates apoptosis and inflammation levels in mice with NAFLD. （生物钟紊乱加重NAFLD小鼠的细胞凋亡和炎症水平）

TUNEL检测表明，NAFLD+CCD组肝组织中的细胞凋亡水平高于NAFLD组。ELISA检测发现，NAFLD+CCD组小鼠血清中的促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的水平也显著高于NAFLD组，说明CCD加剧了NAFLD相关的全身性炎症反应。

Circadian disruption increase the expression of fibrosis-related proteins in the liver tissue of NAFLD mice. （生物钟紊乱增加NAFLD小鼠肝组织中纤维化相关蛋白的表达）

免疫组化结果进一步证实了组织染色的发现。NAFLD+CCD组小鼠肝组织中胶原IV、纤连蛋白和α-SMA的表达量均显著高于NAFLD组，从蛋白分子水平证实了CCD能够上调肝纤维化相关标志物的表达。

Circadian disruption increase the expression of necroptosis-related proteins in the liver tissue of NAFLD mice. （生物钟紊乱增加NAFLD小鼠肝组织中坏死性凋亡相关蛋白的表达）

为了探究CCD加剧NAFLD的潜在细胞死亡机制，研究人员检测了坏死性凋亡关键通路蛋白的表达。Western Blotting结果显示，与NAFLD组相比，NAFLD+CCD组肝组织中p-RIPK1/RIPK1、p-RIPK3/RIPK3和p-MLKL/MLKL的比值均显著升高，表明CCD激活了RIPK1/RIPK3/MLKL介导的坏死性凋亡信号通路。

Circadian disruption enhance the expression of RIPK1 in hepatic macrophages of mice with NAFLD. （生物钟紊乱增强NAFLD小鼠肝脏巨噬细胞中RIPK1的表达）

最关键的问题是，究竟是哪种肝细胞发生了坏死性凋亡？研究人员通过精巧的免疫荧光三重染色进行细胞定位。他们使用IBA1作为巨噬细胞的通用标志物，Clec4F作为库普弗细胞（KCs，肝脏中定居的巨噬细胞）的特异性标志物，并与RIPK1进行共染色分析。结果发现，在NAFLD+CCD组中，RIPK1的增加表达主要与Clec4F阳性的库普弗细胞共定位，而与更广泛的IBA1阳性巨噬细胞的共定位不明显。这强烈提示，生物钟紊乱特异性地促进了肝脏库普弗细胞，而非其他类型的巨噬细胞，发生RIPK1介导的坏死性凋亡。

研究结论与意义

综上所述，本研究得出结论：生物钟紊乱通过激活RIPK1-RIPK3-MLKL信号轴，特异性地诱导肝脏库普弗细胞发生坏死性凋亡，从而加剧高脂饮食诱导的NAFLD小鼠模型的肝脂肪变性、炎症反应、肝细胞损伤和纤维化进程。

这项研究的意义重大。首先，它揭示了一种新的机制，将环境因素（生物钟紊乱）、特定免疫细胞（库普弗细胞）、一种非凋亡性的程序性细胞死亡方式（坏死性凋亡）以及NAFLD的进展联系起来，深化了我们对NAFLD发病机制的理解。其次，研究结果表明，针对RIPK1/RIPK3/MLKL通路的抑制剂，或者采取措施稳定生物节律，可能成为预防或治疗与生物钟紊乱相关的NAFLD的新策略。尽管本研究存在局限性（如缺乏体外细胞实验验证），但作者已规划了未来的研究方向，包括在分离的原代库普弗细胞中模拟生物钟紊乱和NAFLD环境，并使用通路抑制剂进行挽救实验，以进一步确证该机制的必要性。这项工作为开发干预NAFLD进展的潜在新靶点提供了重要的实验依据。