新型鱼腥草素钠通过抑制FGF1表达及p38/MAPK通路调控胰腺癌血管生成的作用机制研究

《Scientific Reports》：Sodium new houttuyfonate affects tumor angiogenesis by suppressing FGF1 expression and the p38/MAPK signaling pathway in pancreatic cancer

本刊编辑推荐：为解决胰腺癌化疗耐药及抗血管生成治疗临床失败的问题，研究人员开展了新型鱼腥草素钠(SNH)抗胰腺癌作用机制研究。结果表明SNH通过下调FGF1表达、抑制p38/MAPK信号通路，显著抑制胰腺癌细胞增殖侵袭、诱导线粒体损伤凋亡，并影响肿瘤血管生成。该研究为胰腺癌治疗提供了新的潜在策略。

　　

胰腺癌作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一，是全球男女人群中癌症相关死亡的第七大原因。在过去的几十年里，胰腺癌的全球负担急剧增加，预计将成为欧洲国家癌症死亡的第三大原因。目前全身化疗仍是胰腺癌的主要治疗手段，吉西他滨作为一线治疗药物，虽然近年来FOLFIRINOX方案和吉西他滨联合白蛋白紫杉醇相比单药治疗改善了生存率，但胰腺癌对多种化疗药物产生耐药性，化疗效果相对较差，且化疗药物常产生严重副作用，降低患者生活质量。

在这种严峻的背景下，植物化学物质因其安全性、低成本、口服生物利用度和潜在的抗癌作用而被认为是潜在的替代或辅助抗癌药物。鱼腥草是中国著名的药食同源植物，而新型鱼腥草素钠(SNH)是鱼腥草挥发油中亚硫酸氢钠与十二酰乙醛的化合物，具有相对稳定性。研究表明SNH具有抗炎、抗真菌、抗病毒和抗癌特性，但其在胰腺癌中的治疗效果和潜在分子机制尚不清楚。

同时，血管生成是肿瘤发展的重要过程。尽管人类胰腺肿瘤被认为是低血管化的，但胰腺癌细胞通过分泌多种促血管生成因子、细胞因子和生长因子诱导血管生成，从而促进肿瘤血液供应和转移。血管内皮生长因子(VEGF)被认为是胰腺肿瘤血管生成的关键介质，但抗VEGF抗体治疗在胰腺癌中的临床应用却遭遇失败。因此，寻找抑制胰腺癌血管生成其他靶点的治疗方法也至关重要。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员通过综合运用网络药理学、体外实验和体内实验，深入探讨了SNH抗胰腺癌的作用机制。研究首次揭示了SNH通过调控FGF1-p38/MAPK轴抑制胰腺癌进展的新机制。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：通过网络药理学筛选SNH作用靶点；采用CCK-8法、克隆形成实验、Transwell实验、流式细胞术等体外细胞功能实验；利用透射电子显微镜观察线粒体形态；通过蛋白质印迹法检测蛋白表达；建立裸鼠异种移植模型进行体内验证；采用RNA测序进行转录组分析；通过免疫组织化学和免疫荧光进行组织学检测。

网络药理学揭示SNH作用于胰腺癌的潜在机制

研究人员首先通过SwissTargetPrediction预测了SNH的潜在靶基因，鉴定了100个关键分子相互作用。通过分析两个胰腺癌相关数据集的基因表达谱，发现2305个共同表达基因。进一步分析确定了49个SNH潜在靶基因与胰腺癌相关。KEGG通路富集分析显示MAPK信号通路是SNH可能发挥作用的前20个潜在信号通路之一。考虑到90%以上胰腺癌存在KRAS基因激活突变，而MAPK通路是KRAS下游的中心信号轴，研究人员推测SNH可能通过作用于MAPK信号通路抑制胰腺癌。

SNH在体外对胰腺癌细胞发挥抗癌活性

通过细胞活力检测发现，SNH处理72小时以浓度依赖性方式显著抑制PANC-1和SW1990细胞的生长和增殖，其中PANC-1细胞对SNH更敏感(IC₅₀=44.53μM)。克隆形成实验显示SNH处理显著降低细胞克隆形成效率。Transwell侵袭实验表明SNH处理显著抑制PANC-1细胞的侵袭能力，同时下调肿瘤转移关键因子MMP2的表达。此外，SNH处理使PANC-1细胞阻滞在S和G2/M期。

SNH诱导胰腺癌细胞线粒体损伤和凋亡

通过AV-FITC双染色检测发现SNH处理诱导PANC-1细胞凋亡。SNH处理上调促凋亡蛋白Bax表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2表达。透射电子显微镜观察显示，与对照组相比，SNH处理细胞线粒体形态异常，表明线粒体损伤。这些结果表明SNH通过诱导细胞线粒体损伤导致凋亡。在SW1990细胞中也观察到一致的促凋亡和抗侵袭效果。

SNH在体内抑制胰腺肿瘤生长且不引起显著宿主毒性

通过建立PANC-1皮下肿瘤模型，发现与对照组相比，SNH治疗组尤其是高剂量组(30mg/kg)显著抑制肿瘤生长。免疫组化检测显示SNH处理显著抑制肿瘤组织中Bcl-2表达，上调Bax表达。重要的是，各治疗组心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏均未观察到明显异常，表明SNH在实验剂量下安全性良好。

MAPK信号通路参与SNH的抗癌活性

通过RNA测序分析发现，SNH处理的细胞和肿瘤组织产生许多上调或下调基因。KEGG富集分析显示，MAPK信号通路在SNH组组织和细胞中均下调。哺乳动物MAPK信号通路主要有三个组成部分：细胞外信号调节激酶(ERK)、Jun N末端激酶(JNK)和p38/MAPK。蛋白质印迹法检测各组ERK(p-ERK)、JNK(p-JNK)和p38/MAPK(p-p38/MAPK)的磷酸化水平，结果显示SNH对p-p38/MAPK蛋白的影响强于其他检测蛋白。免疫荧光分析进一步证实SNH以剂量依赖性方式下调肿瘤组织中p-p38/MAPK表达。在SW1990细胞中也证实了SNH对p-p38/MAPK的下调作用。

SNH通过抑制FGF1表达影响肿瘤血管生成

为研究SNH介导MAPK信号通路调控涉及的基因，研究人员分析了SNH处理细胞和肿瘤中MAPK信号通路相关的转录组数据。通过对三个数据集的联合分析发现FGF1和DUSP4参与SNH介导的MAPK信号通路调控。FGF1在细胞表达中显示出最高变异度，且在动物肿瘤中呈现较好趋势。进一步实验表明，无论是否存在外源性FGF1蛋白，SNH均抑制细胞中FGF1蛋白表达。同样，SNH处理下调异种移植肿瘤中FGF1蛋白表达。在SW1990细胞中也证实了SNH对FGF1的下调作用。

FGF1已被证明对内皮细胞发挥促血管生成作用。基于这些发现，研究人员假设SNH通过抑制FGF1表达来抑制肿瘤内内皮细胞功能，从而发挥抗肿瘤作用。实验证明，SNH处理显著抑制HUVECs的增殖和迁移，而外源性FGF1蛋白的加入显著挽救了这些抑制效应。此外，SNH引起的血管形成能力受损同样被FGF1补充所恢复。通过免疫荧光和免疫组化检测肿瘤血管CD31表达，发现SNH处理显著降低肿瘤中CD31阳性区域和微血管密度(MVD)。

研究结论与讨论部分强调了该研究的重要意义。该研究证实SNH不仅抑制p38/MAPK通路活化，还影响肿瘤血管生成。SNH抑制PANC-1细胞的增殖和侵袭能力，诱导细胞线粒体损伤和凋亡，并在体内抑制胰腺肿瘤生长而不产生显著毒性。同时，SNH通过抑制FGF1表达和p38/MAPK通路磷酸化影响胰腺癌的肿瘤血管生成。

该研究的创新性在于首次将SNH诱导的线粒体损伤与其抗癌活性联系起来，并首次报道了SNH对胰腺癌血管生成的影响。p38/MAPK通路参与胰腺癌的发生、发展和耐药性，抑制p38/MAPK通路活化是治疗胰腺癌的有效手段，也是逆转胰腺癌化疗耐药的有效途径。因此，SNH不仅能抑制胰腺癌生长，还有可能成为胰腺癌联合化疗的潜在药物。

值得注意的是，转录组测序显示FGF1和DUSP4是SNH介导p38/MAPK通路调控的潜在驱动因子。FGF1是参与胰腺癌形成的最重要细胞因子，已被证明与p38/MAPK通路相互作用。除了在肿瘤细胞运动和存活中发挥重要作用外，FGF家族还参与肿瘤血管生成。在过去的几十年里，抗血管生成治疗已成为治疗各种癌症（包括胰腺癌）的合理策略。不幸的是，抗VEGF血管生成治疗在胰腺癌中的临床试验并不理想。因此，FGF1有望成为临床治疗胰腺癌的新抗血管生成靶点。

该研究也存在一些局限性，如大部分体外功能验证在单一细胞系中进行，虽然已在第二细胞系中补充关键实验，但在更广泛的胰腺癌模型中进行验证将增强研究结果的普适性。关于影响肿瘤血管生成的声明主要得到体外内皮细胞测定和体内微血管密度降低的支持，但缺乏血管功能受损的更直接证据。最后，SNH信号网络内的精确机制联系，特别是FGF1下调与p-p38 MAPK抑制之间的因果关系仍有待充分阐明。

综上所述，该研究证实SNH具有作为胰腺癌临床治疗有前景候选药物的潜力，为开发针对胰腺癌的新型治疗策略提供了重要理论基础和实验依据。基于天然产物的抗癌药物研发为克服胰腺癌治疗困境提供了新思路，SNH作为一种具有多重抗肿瘤活性的天然化合物衍生物，值得进一步深入研究和临床转化探索。