OsNF-YC8/9/10通过协同激活SBE3转录冗余调控水稻胚乳直链淀粉合成及抗性淀粉形成

《Plant Communications》：Three transcription factors, OsNF-YC8, OsNF-YC9 and OsNF-YC10, function redundantly to promote amylopectin synthesis by activating SBE3 expression in rice endosperm

本研究针对水稻胚乳中淀粉分支酶SBE3的转录调控机制不清的问题，通过多组学分析发现OsNF-YC8/9/10三个转录因子能直接结合SBE3启动子的AAGAGG motif协同调控其表达。三重突变体osnf-yc8/9/10使SBE3表达下调约50%，导致短链直链淀粉（DP 6-24）比例下降，抗性淀粉含量提升3.7倍，且不影响千粒重和表观直链淀粉含量，为培育高产优质功能稻米提供了新策略。

　　

水稻作为全球最重要的主粮作物之一，其胚乳品质直接影响着亿万人的饮食健康。胚乳中近90%的成分为淀粉，而淀粉的精细结构——特别是直链淀粉与支链淀粉的比例和链长分布——直接决定了稻米的食味品质、外观和营养功能。在支链淀粉合成过程中，淀粉分支酶SBE3（Starch Branching Enzyme 3）发挥着关键作用，其功能缺失会导致籽粒垩白、粒重下降等严重问题。然而，长期以来科学界对SBE3表达的转录调控网络认知仍不清晰，这限制了通过精准调控淀粉合成路径来改良稻米品质的育种实践。

为解决这一科学问题，扬州大学刘巧泉教授团队在《Plant Communications》上发表了最新研究成果。研究人员通过系统解析核因子Y（NF-Y）家族中三个高度同源的转录因子——OsNF-YC8、OsNF-YC9和OsNF-YC10，揭示了它们通过冗余调控SBE3表达，进而影响支链淀粉精细结构和抗性淀粉（Resistant Starch, RS）形成的新机制。该研究不仅阐明了淀粉合成调控网络的关键环节，更为培育高抗性淀粉功能稻米提供了新的理论依据和技术路径。

研究主要运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术构建系列突变体、酵母单杂交（Y1H）筛选、电泳迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶报告系统、扫描电子显微镜（SEM）、尺寸排阻色谱（SEC）和荧光辅助碳水化合物电泳（FACE）等技术方法。实验材料以日本晴（Nipponbare）为背景，通过农杆菌介导的遗传转化获得突变体，并在扬州大学转基因试验场完成田间种植。

OsNF-YC8/9/10特异性表达于水稻胚乳

研究人员通过RT-qPCR分析发现，OsNF-YC8、OsNF-YC9和OsNF-YC10三个基因在灌浆期胚乳中特异性高表达，且在花后10天（10 DAP）达到峰值，而在根、茎、叶等组织中几乎不表达。mRNA原位杂交进一步证实它们的转录本富集在淀粉质胚乳和背部维管束。亚细胞定位显示这三个蛋白均定位于细胞核，符合转录因子的特征。这些表达模式提示它们可能参与胚乳发育的调控。

仅三重突变导致胚乳垩白

利用CRISPR/Cas9技术，研究团队成功获得了OsNF-YC8/9/10的单突变、双突变和三重突变体。表型分析表明，单突变和双突变体在株高、分蘖数、籽粒大小和千粒重等方面与野生型无显著差异。然而，osnf-yc8/9/10三重突变体的成熟籽粒胚乳呈现典型的垩白状，垩白粒率接近100%。扫描电镜显示突变体胚乳中央部位的淀粉颗粒变圆、排列疏松，与野生型多角形紧密排列的形态形成鲜明对比。

转录组分析揭示代谢通路变化

RNA-seq分析发现，三重突变体中共有711个差异表达基因（DEGs），其中433个下调基因主要富集在催化活性和代谢过程相关通路。KEGG分析表明这些基因显著富集于淀粉和蔗糖代谢途径。RT-qPCR验证发现多个淀粉合成相关基因（SSRGs）表达下调，其中SSIIIa和SBE3（即SBEIIb）的转录水平下降最为显著。

OsNF-YC8/9/10直接激活SBE3转录

通过酵母单杂交筛选，研究人员发现OsNF-YC9可结合"CCAAT"和新型"AAGAGGCGAT" motif。进一步分析在SBE3启动子区-254bp处鉴定到"AAGAGG"核心序列。Y1H和EMSA实验证实三个NF-YC蛋白均能特异性结合该 motif。双荧光素酶报告系统显示，每个NF-YC蛋白均可独立激活SBE3启动子，其中OsNF-YC10的转录激活能力最强。竞争性EMSA实验表明三者存在相互竞争结合。

三重突变改变支链淀粉精细结构

SEC和FACE分析表明，虽然三重突变体的表观直链淀粉含量（AAC）与野生型无显著差异，但其支链淀粉链长分布（CLD）发生明显改变：短链（A链，DP 6-12）和中等长度链（B1链，DP 13-24）比例下降，而长链（B2链，DP 25-36；B3链，DP≥37）比例上升。这种变化趋势与sbe3突变体相似，但变化幅度较小，说明三重突变对淀粉分支的抑制程度介于野生型和sbe3突变体之间。

理化特性发生轻微改变

差示扫描量热法（DSC）显示三重突变体的起始温度（T_o）、峰值温度（T_p）和终止温度（T_c）均比野生型降低约1°C，而sbe3突变体则升高近9°C。快速粘度分析仪（RVA）结果表明，突变体的峰值粘度（PV）、热浆粘度（HPV）和冷胶粘度（CV）均低于野生型但高于sbe3突变体。这些变化表明三重突变对食味品质（ECQ）的影响较小。

抗性淀粉含量显著提升

尽管osnf-yc8/9/10三重突变体的抗性淀粉含量（3.7倍）低于sbe3突变体（9倍），但其单株产量与野生型相当，使得单株抗性淀粉产量与sbe3突变体处于同一水平。这种在保持产量的同时提高抗性淀粉含量的特性，使三重突变体在功能稻米育种中具有重要应用价值。

研究结论与讨论部分指出，OsNF-YC8/9/10通过功能冗余机制共同调控SBE3表达，三者具有高度相似的氨基酸序列、表达模式和亚细胞定位。它们的协同作用为淀粉合成提供了稳健而灵活的调控机制。与其它影响垩白形成的NF-Y家族成员（如主要表达于糊粉层的OsNF-YB1和OsNF-YC12）不同，OsNF-YC8/9/10特异表达于淀粉质胚乳，通过精细调控支链淀粉结构而非影响贮藏物质积累来影响胚乳透明度。

该研究的创新性在于首次揭示了NF-YC转录因子通过调控SBE3表达来影响支链淀粉精细结构的分子机制，并证明通过适度下调SBE3（而非完全敲除）可以在不大幅影响产量和食味品质的前提下提高抗性淀粉含量。这一策略成功平衡了"吃饱"、"吃好"和"吃健康"的多重需求，为功能稻米育种提供了新的思路。随着人们健康意识的提升，富含抗性淀粉的主粮作物在预防胰岛素抵抗、糖尿病等代谢性疾病方面展现出广阔前景，而OsNF-YC8/9/10的发现为培育此类功能性水稻品种提供了精准的分子育种靶点。