利用荧光寿命成像显微镜可视化细胞内环境与电场诱导的细胞反应：揭示乳腺癌细胞钙稳态、代谢与膜电位的三角关系

《Scientific Reports》：Visualizing intracellular milieu and electric field-induced cell responses by fluorescence lifetime imaging microscopy

本研究针对癌细胞与正常细胞在钙离子（Ca2+）稳态、膜电位（Vm）及代谢功能方面的差异，通过荧光寿命成像显微镜（FLIM）技术，结合外源性荧光探针（OGB、Fluovolt）和内源性荧光团（NAD(P)H、FAD），系统比较了乳腺癌细胞（MCF7、MDA-MB-231）与正常乳腺上皮细胞（MCF10A）的细胞内环境。研究发现癌细胞呈现Ca2+浓度升高、Vm去极化及NAD(P)H寿命缩短等特征，并利用纳秒脉冲电场（nsPEF）成功诱导MCF7细胞发生Ca2+释放、线粒体功能紊乱和细胞凋亡，而MDA-MB-231和MCF10A细胞对此不敏感。该研究为理解癌细胞电生理特性及开发无药物电场疗法提供了新思路。

　　

在细胞的生命活动中，钙离子（Ca²⁺）扮演着至关重要的信使角色，而细胞膜电位（V_m）则是维持细胞电生理平衡的核心。在癌细胞中，这些精密的调控网络常常失控，导致细胞增殖、代谢和死亡信号通路紊乱，从而促进肿瘤的发展。然而，传统基于荧光强度的成像方法易受染料浓度、激发光功率等因素干扰，难以精确捕捉癌细胞与正常细胞之间细微而关键的动态差异。此外，如何以一种非侵入性、无药物的物理方式特异性调控癌细胞的内部环境，诱导其走向死亡，同时尽量减少对正常细胞的影响，一直是癌症治疗研究中的一个挑战。

为了回答这些问题，由Kamlesh Awasthi、Wei-Chen Huang、Hsin-Yun Hsu和Nobuhiro Ohta组成的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究。他们利用荧光寿命成像显微镜（FLIM）这一强大工具，因为它所测量的荧光寿命（FL）不受探针浓度、激发光强度或光漂白的影响，能够更可靠地反映细胞功能和动态变化。研究人员重点关注了两种具有不同受体状态（ER/PR/HER2）的乳腺癌细胞系MCF7和MDA-MB-231，以及正常的乳腺上皮细胞MCF10A，旨在揭示它们在内环境方面的根本差异，并探索纳秒脉冲电场（nsPEF）作为一种潜在治疗手段的有效性。

本研究主要运用了几项关键技术：荧光寿命成像显微镜（FLIM）和自发荧光寿命成像（AFLIM）用于定量检测细胞内Ca²⁺（使用Oregon Green 488 BAPTA-1, AM (OGB)探针）、膜电位V_m（使用Fluovolt染料）以及内源性代谢辅酶NAD(P)H和FAD的荧光寿命；利用定制的三维微电极装置对贴壁培养的细胞施加纳秒脉冲电场（nsPEF，50 ns脉宽，20 kV/cm强度），并实时监测电场引起的细胞内变化；通过MitoSOX?荧光探针检测线粒体超氧阴离子（O₂^•–）水平，并使用活/死细胞染色试剂盒评估细胞活力。研究所用细胞系（MCF7, MDA-MB-231, MCF10A）购自台湾生物资源保存及研究中心（BCRC）和Blossom Biotechnologies Inc.。

Mapping of Intracellular Ca²⁺Ion Concentration and Distribution.

研究人员通过FLIM分析OGB的荧光寿命，发现癌细胞（MCF7和MDA-MB-231）内的Ca²⁺浓度显著高于正常MCF10A细胞。OGB与Ca²⁺结合后其荧光寿命会延长。分析显示，癌细胞中与Ca²⁺结合的长寿命组分占比更大，导致平均寿命更长。此外，Ca²⁺在细胞内的分布也不同：MCF7细胞的Ca²⁺分布广泛，包括细胞核；而MDA-MB-231和MCF10A细胞的Ca²⁺更多集中在细胞质。特别值得注意的是，MCF10A细胞质膜区域的OGB寿命比其他区域更长，这与癌细胞形成鲜明对比。在肺癌细胞（H661）与正常肺细胞（MRC-5）的对比中也观察到类似现象，表明癌细胞具有更高的细胞内Ca²⁺水平是一种普遍特征。

Autofluorescence Lifetime Images(AFLIMs) of NAD(P)H and FAD.

通过测量内源性代谢辅酶NAD(P)H和FAD的自发荧光寿命，研究人员评估了线粒体功能和细胞代谢状态。结果显示，正常MCF10A细胞的NAD(P)H和FAD的平均荧光寿命均显著长于两种癌细胞（MCF7和MDA-MB-231），寿命缩短约30%至40%。这种差异可能与癌细胞更依赖糖酵解，而正常细胞更依赖氧化磷酸化有关，同时也暗示了这些辅酶与细胞内蛋白质结合状态的差异。此外，正常MCF10A细胞中FAD的荧光光谱发生蓝移，可能反映了黄素单核苷酸（FMN）与FAD发射光谱的重叠，这在癌细胞中不明显。而NAD(P)H的荧光光谱在不同细胞间则很相似。研究还发现，细胞状态（贴壁 vs. 悬浮）显著影响NAD(P)H和FAD的荧光寿命，突出了微环境的重要性。

Mapping of Vm through the FLIMs of Fluovolt.

利用膜电位敏感染料Fluovolt的FLIM成像，研究人员发现癌细胞的膜电位（V_m）处于去极化状态（表现为Fluovolt荧光寿命延长），而正常MCF10A细胞的膜电位相对更超极化（寿命较短）。其中，MDA-MB-231细胞的去极化程度比MCF7细胞更高。这一发现与癌细胞具有更高细胞内Ca²⁺浓度的结果相互关联，因为Ca²⁺稳态与膜电位密切相关。

Modulation of the Intracellular Ca²⁺, NAD(P)H, and Vm by Applied Electric Field.

这是本研究最核心的干预部分。研究人员应用nsPEF（50 ns脉宽，20 kV/cm）刺激细胞，观察其对细胞内环境的实时影响。结果发现，nsPEF的效应具有显著的细胞类型特异性。在MCF7细胞中，nsPEF应用后首先引起细胞内Ca²⁺浓度的瞬时升高，这很可能源于nsPEF直接作用于内质网（ER），导致Ca²⁺释放。随后，NAD(P)H的荧光寿命延长，同时线粒体内超氧阴离子（O₂^•–）水平显著增加，并且细胞膜电位进一步去极化。这些变化是线粒体介导的细胞凋亡的典型特征。细胞活力实验证实，nsPEF处理确实导致了MCF7细胞的死亡。然而，在MDA-MB-231和MCF10A细胞中，nsPEF未能引起Ca²⁺、NAD(P)H荧光寿命或膜电位的显著变化，线粒体超氧阴离子水平也未明显升高，表明这两种细胞对所用参数的nsPEF不敏感，存活率较高。这种差异可能与细胞的ER/PR/HER2状态、介电常数或细胞内局部电场的不同有关。

结论与意义

本研究通过高分辨率的FLIM技术，清晰地描绘了乳腺癌细胞（MCF7, MDA-MB-231）与正常乳腺细胞（MCF10A）在细胞内Ca²⁺稳态、代谢功能（通过NAD(P)H和FAD表征）和膜电位（V_m）方面存在的显著差异，揭示了它们各自独特的细胞内环境“指纹”。更重要的是，研究成功地利用nsPEF这种物理刺激，特异性地扰动了MCF7癌细胞内的钙信号和线粒体功能，诱导其走向凋亡，而对MDA-MB-231癌细胞和正常MCF10A细胞影响甚微。这一发现具有多重重要意义：首先，它证实了癌细胞与正常细胞之间，以及不同亚型癌细胞之间，其电生理特性存在根本差异，这种差异可能成为新的治疗靶点。其次，它展示了nsPEF作为一种无药物、非热效应的生物物理方法，在选择性靶向特定类型癌细胞方面的巨大潜力，为开发新型的“电疗”策略提供了坚实的实验依据。最后，该研究强调了局部电场（其强度在细胞内可能高达MV/cm量级）在调控细胞生命活动中的关键作用，为理解细胞间竞争、信号传导等基本生物学过程提供了新的视角。总之，这项工作不仅深化了我们对癌细胞生物电学的认识，也为未来精准癌症治疗开辟了新的可能途径。