培美曲塞通过诱导氧化应激损害小鼠卵母细胞质量并影响胚胎发育

《Scientific Reports》：Pemetrexed negatively impacts embryonic development by inducing oxidative stress in mouse oocytes

本研究聚焦化疗药物对女性生育力的潜在影响，发现培美曲塞(Pemetrexed)通过扰乱胆碱-甲基代谢通路，诱导线粒体功能障碍和氧化应激(ROS)，导致小鼠卵母细胞核成熟（纺锤体/染色体异常）与质成熟（肌动蛋白聚合、内质网分布异常）受损，最终降低囊胚形成率。该成果为临床化疗方案选择及生殖功能保护提供了重要理论依据。

　　

随着医疗技术的进步，癌症患者的生存率显著提高，越来越多的女性癌症患者在肿瘤治愈后希望拥有自己的后代。然而，肿瘤治疗药物普遍具有细胞毒性，如何避免这些药物对生育能力的不良影响变得尤为重要。培美曲塞作为一种多靶点抗叶酸药物，在非小细胞肺癌、间皮瘤等恶性肿瘤的治疗中扮演着关键角色。尽管其耐受性总体良好，但患者仍可能经历骨髓抑制、胃肠道症状等多种副作用，影响生活质量。值得注意的是，培美曲塞的毒性机制涉及干扰核酸合成、诱导活性氧（ROS）产生和细胞凋亡，但其对女性生殖细胞，特别是卵母细胞的具体影响尚属未知领域。

卵母细胞的正常发育是生命繁衍的基础，其质量优劣直接关系到受精成功与否和早期胚胎发育的潜能。卵母细胞的成熟过程包括核成熟与质成熟两个核心环节。核成熟确保减数分裂过程中纺锤体的正确组装和染色体的精确分离；质成熟则涉及细胞器（如线粒体、内质网）的功能与分布、能量代谢稳态等，为受精和后续胚胎发育奠定基础。卵母细胞质量差是导致动物生育力受损的关键内在原因之一。鉴于培美曲塞在临床的广泛应用及其潜在的生殖毒性风险，探究其对卵母细胞质量的影响具有重要的理论和实践意义。发表在《Scientific Reports》上的这项研究，首次系统揭示了培美曲塞暴露对小鼠卵母细胞成熟及胚胎发育的负面影响及其分子机制。

为开展此项研究，研究人员主要运用了几项关键技术方法：使用6周龄雌性ICR小鼠，通过腹腔注射培美曲塞建立体内暴露模型，并收集卵母细胞和胚胎；利用免疫荧光染色技术分析卵母细胞中纺锤体（α-tubulin）、染色体、肌动蛋白丝（F-actin）、内质网、线粒体等的形态与分布；采用非靶向液相色谱-质谱联用（LC-MS）代谢组学技术全面分析卵母细胞内代谢物的变化；通过特异性荧光探针（如DCFH-DA用于ROS，JC-1用于线粒体膜电位MMP，Annexin-V用于细胞凋亡）结合荧光强度定量，检测卵母细胞内的氧化应激水平、线粒体功能状态和早期凋亡情况；并使用ATP检测试剂盒测定卵母细胞内的ATP含量。

3.1. 培美曲塞暴露影响小鼠卵母细胞的成熟

研究人员首先通过体内实验评估了培美曲塞对卵母细胞成熟和胚胎发育能力的影响。极体 extrusion (PBE) 是卵母细胞完成第一次减数分裂、进入成熟阶段的关键形态学标志。结果显示，培美曲塞暴露显著降低了卵母细胞的PBE率。此外，囊胚形成率高度依赖于卵母细胞的质量。研究发现，培美曲塞处理组的小鼠囊胚形成率也显著低于对照组，表明培美曲塞暴露损害了卵母细胞的发育潜能，可能导致雌性小鼠的生育力下降。

3.2. 培美曲塞破坏小鼠卵母细胞的纺锤体/染色体结构

卵母细胞减数分裂的顺利进行依赖于正常的纺锤体结构和染色体排列。免疫荧光染色发现，对照组卵母细胞具有典型的纺锤体结构和整齐排列的染色体。而培美曲塞暴露导致卵母细胞纺锤体形态异常和染色体排列错误的比率显著增加。同时，乙酰化微管（Ac-tubulin）的荧光信号在暴露组也明显减弱，表明培美曲塞干扰了细胞骨架的正常结构和功能。

3.3. 培美曲塞破坏小鼠卵母细胞的肌动蛋白聚合和内质网分布

细胞骨架的动态重塑对于卵母细胞的不对称分裂至关重要。通过鬼笔环肽（phalloidin）标记F-肌动蛋白（F-actin），发现培美曲塞暴露组卵母细胞的肌动蛋白丝信号强度显著弱于对照组，提示肌动蛋白的聚合过程受到干扰。内质网（ER）作为重要的钙库和蛋白质合成场所，其分布模式也因培美曲塞暴露而发生改变，荧光信号减弱，这可能影响卵母细胞的胞质成熟和后续的受精过程。

3.4. 培美曲塞通过胆碱-甲基代谢途径破坏卵母细胞的氧化还原稳态

为了深入探究培美曲塞影响卵母细胞质量的代谢基础，研究人员采用了非靶向代谢组学分析。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）能明显区分培美曲塞组和对照组的代谢谱。火山图分析筛选出7种上调代谢物和33种下调代谢物。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，胆碱代谢、叶酸转运与代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢是受影响最显著的途径。进一步分析发现，胆碱-甲基代谢通路中的关键代谢物（如胆碱、肌酸）水平显著降低。胆碱代谢与细胞膜磷脂合成密切相关，其紊乱可能影响细胞膜流动性。肌酸参与细胞内的能量缓冲系统（磷酸肌酸通路）。代谢紊乱可能限制了甲基化过程，并消耗大量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），导致还原型谷胱甘肽（GSH）减少和氧化型谷胱甘肽（GSSG）积累，最终引发氧化应激。实验数据也证实，暴露组卵母细胞内NADPH和GSSG水平确实下降，支持了这一补偿反应和氧化应激的存在。

3.5. 培美曲塞破坏小鼠卵母细胞的线粒体功能

线粒体是细胞的能量工厂和ROS的主要来源。研究发现，培美曲塞暴露破坏了卵母细胞中线粒体的均匀分布。同时，卵母细胞内的ATP含量也显著降低。通过JC-1探针评估线粒体膜电位（MMP），发现暴露组卵母细胞的红绿荧光信号比值（高MMP/低MMP）显著下降，表明线粒体功能受损，膜电位降低。这些结果共同表明培美曲塞诱导了卵母细胞的线粒体功能障碍。

3.6. 暴露于培美曲塞的小鼠卵母细胞ROS生成增加并引发凋亡

与代谢组学提示的氧化应激一致，直接检测显示培美曲塞暴露组卵母细胞内的ROS水平显著高于对照组。过度的氧化应激可触发细胞凋亡。通过Annexin-V染色评估早期凋亡，发现培美曲塞暴露导致卵母细胞的凋亡信号显著增强，而对照组卵母细胞的凋亡信号很弱。这证明培美曲塞诱导的氧化应激最终导致了卵母细胞的程序性死亡。

综上所述，本研究得出结论：培美曲塞暴露会干扰小鼠卵母细胞内的胆碱-甲基代谢通路，诱导线粒体功能障碍和氧化应激（ROS水平升高），进而损害卵母细胞的核成熟（纺锤体异常、染色体排列错误）和质成熟（肌动蛋白聚合受损、内质网分布异常），并引发早期凋亡，最终导致胚胎发育潜能下降，对雌性小鼠的生育力产生负面影响。这项研究首次系统地揭示了培美曲塞对女性生殖细胞的毒性作用及其分子机制，将药物毒性、代谢紊乱、氧化应激、细胞器功能异常和生殖细胞发育缺陷联系起来，为临床评估化疗药物对女性生育力的潜在风险提供了重要的实验依据，对指导癌症患者（尤其有生育需求者）的个体化治疗和生殖功能保护策略的制定具有重要的意义。未来的研究可探索在化疗期间联用抗氧化剂或其他保护性药物，以减轻培美曲塞等化疗药物对卵巢功能和卵母细胞质量的不利影响。