单细胞蛋白质组学揭示人胶质母细胞瘤中中性粒细胞功能状态的异质性图谱

《Nature Communications》：Single cell proteomic analysis defines discrete neutrophil functional states in human glioblastoma

为解决中性粒细胞在胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤微环境中的功能异质性难题，研究人员通过开发超灵敏单细胞蛋白质组学(SCP)技术，首次在单细胞分辨率下系统描绘了肿瘤相关中性粒细胞(TAN)的7种功能状态集群。该研究突破了传统转录组学的局限，发现包括免疫抑制/促血管生成、裂解性NETosis等新型细胞状态，为靶向促肿瘤中性粒细胞亚群提供了新策略。

　　

在恶性程度最高的原发性脑肿瘤——胶质母细胞瘤(GBM)的复杂微环境中，中性粒细胞作为数量最丰富的免疫细胞群体，其功能状态一直充满争议。传统观点认为这些细胞可能发挥抗肿瘤作用，但近年研究显示它们更常促进肿瘤生长、血管生成和免疫抑制。由于中性粒细胞存在显著的mRNA-蛋白质表达解离现象，单细胞转录组测序(scRNA-seq)难以准确反映其真实功能状态。更关键的是，单个中性粒细胞仅含约60皮克蛋白质，远低于常规蛋白质组学分析所需样本量，导致其功能异质性研究长期处于空白状态。

为突破这一技术瓶颈，来自爱丁堡大学和维也纳生物中心的Pranvera Sadiku、Alejandro J. Brenes等研究人员在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。团队建立了超灵敏微型批量(500细胞)和单细胞蛋白质组学(SCP)工作流程，首次在单细胞分辨率下系统解析了人胶质母细胞瘤中中性粒细胞的功能状态异质性。

研究团队通过优化样本处理流程，使用细胞分选技术将中性粒细胞直接分选至384孔板，结合细胞一号(cellenONE)自动化处理系统和轨道阱阿斯特拉(Orbitrap Astral)质谱仪，建立了高通量单细胞蛋白质组分析平台。研究队列包括6名GBM患者的外周血和肿瘤样本，通过流式细胞术分选CD45⁺CD66b⁺CD49d^-的肿瘤相关中性粒细胞(TAN)进行分析。

关键技术方法概述

研究建立了三种蛋白质组学工作流程：标准批量(200万细胞)、微型批量(500细胞)和单细胞分析。采用高灵敏度质谱仪结合FAIMS Pro Duo接口，使用数据非依赖采集(DIA)模式。通过Spectronaut软件进行数据分析，采用相对iBAQ(riBAQ)标准化方法。单细胞数据使用Seurat和Harmony进行聚类分析和批次校正。

微型批量分析揭示中性粒细胞成熟状态特征

研究人员首先通过微型批量蛋白质组学比较了循环中性粒细胞不同亚群：正常密度成熟(NDN CD10⁺)、低密度成熟(LDN CD10⁺)、低密度未成熟(LDN CD10^-)以及肿瘤相关中性粒细胞(TAN)。结果显示，未成熟中性粒细胞高表达核糖体蛋白和DNA复制相关蛋白，而成熟中性粒细胞则富集迁移和炎症反应相关蛋白。重要的是，TAN与循环成熟中性粒细胞高度相似，仅线粒体代谢蛋白表达呈现中间状态。

单细胞蛋白质组学定义七种功能状态集群

通过分析277个单细胞中性粒细胞的蛋白质组数据，研究团队鉴定了七个功能不同的细胞集群：武装型、交战型、存活NETs型、耗竭型、免疫抑制与血管生成型、裂解NETs型和血管未成熟型。其中，武装型中性粒细胞富含细胞骨架蛋白和颗粒蛋白，表现出最强的运动能力和效应功能；而交战型则显示颗粒蛋白释放特征，表明其正处于活化状态。

血管内未成熟中性粒细胞与裂解性NETosis群体

值得关注的是，仅8%的肿瘤中性粒细胞呈现未成熟特征，这些细胞高表达增殖细胞核抗原(PCNA)和转录因子CEBPE，并富集补体和凝血相关蛋白，提示它们主要滞留于血管内。另一独特群体——裂解NETs中性粒细胞，则表现出组蛋白和颗粒蛋白的显著缺失，同时补体/凝血蛋白富集，符合细胞发生裂解性NETosis的特征。

免疫抑制与血管生成群体的特殊功能

免疫抑制与血管生成型中性粒细胞高表达精氨酸酶1(ARG1)和S100A7等免疫抑制分子，以及细胞外基质蛋白1(ECM1)等促血管生成因子。该群体还表现出增强的溶酶体和泛素-蛋白酶体活性，并含有大量免疫球蛋白和非中性粒细胞特异性蛋白，提示其具有活跃的吞噬功能。

中性粒细胞功能状态转变轨迹

研究还揭示了中性粒细胞在肿瘤微环境中的动态转变过程：从武装状态开始，经历颗粒释放（交战状态），最终走向耗竭或存活NETosis。耗竭型中性粒细胞表现出代谢能力严重受损，关键糖酵解酶和信号分子表达显著下调。

这项研究不仅建立了适用于低蛋白含量细胞的单细胞蛋白质组学技术平台，更重要的是提供了中性粒细胞功能异质性的蛋白质组学视角。研究发现的功能状态集群，特别是那些通过转录组学无法识别的群体（如NETosis细胞），为理解中性粒细胞在肿瘤进展中的作用提供了新见解。该技术平台可广泛应用于各种疾病背景下免疫细胞的功能研究，为开发靶向特定中性粒细胞亚群的精准免疫治疗策略奠定基础。