在复杂体外生物系统中重构转录-翻译偶联的DNA复制：LoopReX系统推动人工生命设计

《Nature Communications》：Reconstituting transcription–translation-coupled DNA replication within complex in vitro biological systems

本文聚焦于构建人工生命系统的核心挑战——如何实现遗传信息流的自我维持。研究人员开发了名为LoopReX的体外无细胞系统，利用大肠杆菌粗提物成功重构了转录-翻译偶联的DNA复制（TTcDR）过程。该系统通过phi29DNAP和T7RNAP的最小化机器、机器学习优化配方以及基于CipB的人工类核结构，实现了可持续的遗传迭代和高产率蛋白质合成。这项发表于《Nature Communications》的工作为合成生物学和人工细胞研究提供了强大平台。

　　

构建能够自我复制和代谢的"人工生命"是合成生物学领域的终极目标之一。其中，实现中心法则的核心过程——即遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的流动——在体外系统中的耦合与循环，是迈向这一目标的关键步骤。然而，现有技术平台，如使用纯化元件的PURE（Protein synthesis Using Recombinant Elements）系统，虽然能够重建某些孤立的生命特征，但其相对简化的生化环境难以整合多种生命活动，限制了复杂人工生命系统的构建。近年来，基于细胞裂解液的无细胞表达系统（Cell-Free Expression system, CFE）因其包含更接近天然细胞质的复杂生物分子网络而受到关注，为重构更贴近真实生命的过程提供了可能。但在此之前，尚未有研究能在如此复杂的裂解液基系统中成功实现转录-翻译偶联的DNA复制（Transcription-Translation-coupled DNA replication, TTcDR）。

为了解决这一挑战，上海科技大学李健（Jian Li）和凌盛杰（Shengjie Ling）团队及其合作者在《自然-通讯》（Nature Communications）上发表论文，报道了他们开发的名为LoopReX（Loop of DNA replication and protein expression）的新型无细胞平台。该系统成功地在基于大肠杆菌粗提物的复杂体外环境中重构了TTcDR，将DNA复制、转录、翻译以及人工类核（artificial nucleoid）空间区室化等多个核心生命过程整合于一体。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：基于大肠杆菌粗提物的无细胞基因表达系统构建、利用phi29 DNA聚合酶（phi29DNAP）进行滚环DNA复制、T7 RNA聚合酶（T7RNAP）介导的转录及其产物作为复制引物的机制研究、机器学习（XGBoost模型）驱动的多参数系统优化、以及基于细菌包涵体蛋白CipB构建人工类核结构以实现DNA空间组织和保护。

研究结果

1. Establishment of LoopReX by reconstituting TTcDR in vitro

研究人员首先成功地将phi29DNAP介导的DNA复制机器引入大肠杆菌粗提物CFE系统中，构建了LoopReX系统。实验证明，无论是环状单链DNA（cssDNA）还是环状双链DNA（cdsDNA）模板，LoopReX均能有效支持DNA复制，并且其蛋白质表达（以sfGFP为报告蛋白）效率也高于传统CFE系统。通过改变T7RNAP的用量和测试不同类别的T7启动子（如φ10, φ1.1B, φ1.3, φ13）的功能，研究人员阐明了T7RNAP在DNA复制起始中的关键作用：其转录产生的RNA产物（包括流产转录短产物和可能被降解的mRNA）可作为phi29DNAP启动DNA复制的引物。受T7噬菌体基因组复制起点结构的启发，他们理性设计了由串联重复的T7启动子（如3*φ10）构成的人工复制起点（artificial replication origin）。将其插入质粒的合适位置后，不仅提高了DNA复制效率，也意外地提升了蛋白质表达水平，表明人工起点的位置对协调复制与转录过程至关重要。

2. Machine learning-driven optimization of the TTcDR process in LoopReX

鉴于LoopReX系统内组分复杂，传统的单因素优化方法难以高效协调DNA复制、转录和翻译这三个对反应条件要求可能不同的过程。研究团队采用机器学习方法（XGBoost模型）对系统中16个关键反应组分（如镁离子、谷氨酸盐、核苷酸、dNTPs等）的浓度进行全局优化。模型在预测DNA复制和蛋白质表达水平上表现出高精度（测试集R2分别达0.81和0.88）。通过实验验证筛选出的最优配方（F3，即LoopReX-Opt），该系统在DNA复制（0.5小时内含量翻倍）和蛋白质表达（3小时即达峰值）方面均获得显著提升，实现了更快速、高效的遗传信息流。

3. In vitro TTcDR enables sustainable and iterative flow of genetic information

优化后的LoopReX-Opt系统展现了强大的可持续遗传信息流动能力。通过连续稀释迭代反应，系统能够维持多轮DNA复制。在饱和迭代反应中，利用前一轮反应产物作为种子接种到新鲜体系中，经过5轮迭代，初始1 nM的DNA模板理论上可累积产生约760 μg的蛋白质，是传统CFE系统的3.6倍。此外，通过模拟细胞培养的放大流程进行体积放大迭代反应，结果表明体外DNA复制放大不仅能减少DNA投入量，还能显著提高最终蛋白质产量。结合使用含有人工复制起点的质粒，蛋白质产量可进一步提升2.5倍。

4. Artificial nucleoid enhances the performance of in vitro TTcDR

为了模拟细胞内DNA的空间组织与保护机制，研究人员利用细菌包涵体蛋白CipB的自组装特性，构建了无膜的人工类核结构。他们将CipB与链霉亲和素（streptavidin）融合，从而能够特异性结合生物素（biotin）修饰的线性双链DNA（ldsDNA）。电泳迁移率变动分析（EMSA）和透射电子显微镜（TEM）证实了人工类核的成功形成。功能实验表明，将携带人工起点和sfGFP基因的双生物素修饰ldsDNA加载到人工类核上后，DNA复制效率最高提升了7倍，蛋白质表达也显著增强，这得益于类核结构对DNA模板的保护作用（避免核酸酶降解）。此外，人工类核可通过离心回收并重复使用至少5个周期，仍保持大部分DNA和蛋白质表达活性。更重要的是，研究实现了人工类核在LoopReX-Opt系统中的从头自主形成：通过共表达CipB-streptavidin和功能蛋白（如CipB-LacZ，即β-半乳糖苷酶），并与相应的双生物素修饰DNA模板结合，成功构建了具有催化功能的人工类核复合物，并能通过多轮自我生长增强酶活性，初步展示了集成代谢功能的能力。

结论与意义

本研究成功地在复杂的粗提物基无细胞系统中重构了TTcDR，标志着人工生命构建迈出了重要一步。其核心创新在于：1） 揭示了phi29DNAP与T7RNAP在复制起始中的协同机制，验证了RNA转录产物作为复制引物的古老功能，为理解生命早期进化提供了线索；2） 利用机器学习高效优化了复杂生物系统，实现了DNA复制与蛋白质表达的协同最大化；3） 引入了人工类核结构，模拟了天然细胞的DNA空间组织方式，显著提升了TTcDR效率并拓展了功能集成能力；4） 系统支持可持续、可迭代、可放大的遗传信息流，为高通量蛋白质生产和长周期人工生命研究奠定了基础。

LoopReX平台超越了现有系统（如PURE）在复杂性和功能性上的局限，将多种生命特征模块整合于单一系统中。它不仅为设计和研究人工细胞提供了强大工具，也在生物技术、生物制造以及生物-非生物杂合系统等领域展现出广阔的应用前景。尽管在系统长期稳定性和引入更复杂生命过程方面仍面临挑战，但这项工作无疑为最终实现功能完备的人工生命系统开辟了新的道路。