新型广谱CRISPR相关环化核酸酶Crn4的结构与机制解析

《Nature Communications》：Structure and mechanism of the broad spectrum CRISPR-associated ring nuclease Crn4

本研究针对III型CRISPR系统cOA信号分子降解机制存在的认知空白，系统解析了新型环化核酸酶Crn4家族的三维结构与催化机制。研究发现Crn4采用全新非Rossmann折叠结构，可广谱降解cA3/cA4/cA6等多种信号分子，其编码基因在噬菌体中的存在提示潜在抗CRISPR功能，为理解原核生物抗病毒免疫调控提供了新范式。

　　

在微生物与病毒永无休止的军备竞赛中，原核生物演化出了精妙的CRISPR-Cas适应性免疫系统。其中III型CRISPR系统通过检测外来遗传物质RNA后，由Cas10亚基合成环化寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate, cOA）第二信使分子，进而激活多种辅助效应蛋白来执行抗病毒功能。然而这种强大的免疫反应需要精确调控，否则持续活化的效应蛋白可能对宿主细胞造成伤害。因此，降解cOA信号的环化核酸酶（ring nuclease）成为重置免疫系统的关键开关。

目前已知的环化核酸酶如Crn1-3家族均采用Rossmann折叠结构域，且主要特异性降解cA₄。但随着研究发现cA₃和cA₆等不同链长的cOA分子也能激活特定效应蛋白，科学界开始质疑：是否存在更广谱的cOA降解机制？自然界是否演化出了结构全新的环化核酸酶？这些问题成为理解III型CRISPR免疫调控的关键谜题。

近日，《Nature Communications》发表了英国圣安德鲁斯大学Malcolm F. White团队的最新研究，报道了一个具有全新蛋白折叠结构的广谱环化核酸酶家族Crn4，揭示了其独特的催化机制和生物学功能。研究人员通过生物信息学分析发现，在III-D型CRISPR基因座中保守存在一个未知功能的小开放阅读框，将其命名为CRISPR环化核酸酶4（Crn4）。该系统研究综合运用X射线晶体学、酶动力学分析和体内功能验证等多种技术手段，首次揭示了Crn4的非典型二聚体结构及其对多种cOA分子的广谱降解活性。

关键技术方法包括：通过生物信息学筛选鉴定Crn4同源蛋白；利用大肠杆菌表达系统重组纯化Crn4a/Crn4b蛋白；采用高效液相色谱（HPLC）分析酶促反应动力学；通过X射线晶体学解析apo状态及cA₆复合物三维结构；使用质粒挑战实验验证体内功能。

Identification of the CRISPR associated protein Crn4

研究人员通过对III型CRISPR基因座的系统扫描，在12个III-D型CRISPR基因座中发现了一个编码未知功能蛋白的小开放阅读框。该基因与cA₆激活的效应蛋白Csm6-2和CorA膜效应蛋白紧密连锁，其中5个案例中三者共存，2个案例中与Csm6-2融合表达。利用隐马尔可夫模型（HMM）谱图进一步鉴定出22个同源蛋白，分为Crn4a和Crn4b两个亚家族。值得注意的是，Crn4b同源物也存在于噬菌体和质粒基因组中，提示其可能作为抗CRISPR（Acr）蛋白发挥功能。

Crn4a is a ring nuclease with broad specificity

选择 Actinomyces procaprae 来源的Crn4a进行功能表征，发现该酶能降解cA₃、cA₄和cA₆多种cOA分子，降解速率常数分别为0.083±0.02 min^-1、0.98±0.1 min^-1和0.024±0.007 min^-1。对cA₄和cA₆的切割产生线性cA₂>P和cA₃>P产物，表明在分子对称轴两侧发生协同或顺序切割；而cA₃则被不对称降解为A₂>P和A₁>P。这种广谱活性在已知环化核酸酶中尚属首次发现。Crn4b仅能降解cA₃和cA₄，且反应过程中可检测到线性A₃>P和A₄>P中间产物，支持顺序切割机制。

Structure and mechanism of Crn4

晶体结构解析显示Crn4采用全新的二聚体折叠模式，与蛋白质数据库（PDB）中任何已知结构均无显著相似性（DALI Z值<2.6）。核心结构由4-5对β链和1个短α螺旋构成，其中一个单体的延伸β-发夹结构通过疏水相互作用包裹相邻亚基。cA₆结合实验显示配体位于二聚体界面，六个腺嘌呤碱基呈现独特空间取向，与Csm6结合模式显著不同。关键残基R112与磷酸基团形成静电相互作用，H15可能作为广义酸参与催化。配体结合诱导β-发夹发生构象变化，使H15和R112分别移动6?和7?形成活性中心。点突变实验证实H15A和R112A突变完全消除酶活，而T13A保留部分活性。

Crn4 is functional in vivo

通过重构结核分枝杆菌（M. tuberculosis）III-A型CRISPR系统进行质粒挑战实验，发现Crn4a能有效缓解由cA₄激活的TsuCsx1和cA₆激活的MtbCsm6效应蛋白介导的质粒免疫，但对Csm6-2效应蛋白的免疫活性无显著影响。这种功能差异可能源于Csm6-2自身具备的cA₆环化核酸酶活性，或两者对cA₆亲和力的差异。

本研究首次报道了具有全新折叠结构的环化核酸酶家族Crn4，突破了现有环化核酸酶均基于Rossmann折叠的认知框架。其广谱底物特异性（包括首个被确认的CRISPR相关cA₃降解活性）为理解cOA信号网络的复杂性提供了新视角。Crn4在噬菌体基因组中的存在暗示其可能作为新型抗CRISPR蛋白，介导病毒对宿主免疫的逃逸。更重要的是，该研究揭示了III型CRISPR系统中固有环化核酸酶效应蛋白与专职环化核酸酶共存的生物学意义：在高强度cOA信号环境下，Crn4提供了一种不依赖毒性效应蛋白激活的cOA清除机制，确保免疫应答的适时终止。这些发现不仅拓展了环化核苷酸结合蛋白的结构多样性认知，也为开发基于CRISPR的新型生物技术工具提供了理论依据。