复制缺陷型猴痘病毒平台的构建及其在抗病毒先导化合物G243-1720发现中的应用

《Nature Communications》：Development of a replication-defective mpox virus platform for fundamental and therapeutic research

《自然·通讯》编辑推荐：为应对全球猴痘（mpox）疫情，解决在高级别生物安全（BSL-3）条件下研究MPXV的瓶颈，研究人员开发了一种复制缺陷型猴痘病毒（rdMPXV）平台。该平台通过CRISPR-Cas9和Lambda Red重组技术删除了病毒组装必需基因OPG96和OPG158，可在BSL-2条件下安全使用。利用此平台进行高通量筛选，研究者发现了新型抗病毒化合物G243-1720，其通过诱导OPG57（F13）蛋白二聚化抑制病毒传播，机制与特考韦瑞（tecovirimat）类似，展现出良好的成药前景。

　　

近期，全球多地爆发的猴痘（mpox）疫情，特别是由猴痘病毒（MPXV）分支IIb和Ib引起的传播，已多次被世界卫生组织宣布为国际关注的突发公共卫生事件。猴痘病毒是一种具有复杂基因组的痘病毒，其研究通常需要在生物安全三级（BSL-3）实验室进行，这极大地限制了针对该病毒的生物学基础研究和抗病毒药物研发。目前，仅有特考韦瑞（tecovirimat）和西多福韦（cidofovir）等少数药物被批准用于猴痘的应急治疗，且其疗效和安全性仍需进一步验证。因此，开发一种能够在较低生物安全级别下安全、便捷地研究MPXV的工具平台，对于加速科学认知和药物发现至关重要。

在此背景下，由复旦大学等机构的研究人员领导的一项研究，在《自然·通讯》（Nature Communications）上发表论文，报道了他们成功构建的一种复制缺陷型猴痘病毒平台，并利用该平台筛选出一种具有广谱抗痘病毒活性的先导化合物G243-1720。这项研究为解决上述瓶颈问题提供了有力的技术手段和潜在的候选药物。

为开展此项研究，作者团队运用了几项关键技术：首先，利用酵母中的转化相关重组（TAR）克隆技术，从头组装了缺失关键基因OPG96的MPXV基因组细菌人工染色体（BAC）。随后，结合CRISPR-Cas9基因编辑和大肠杆菌中的Lambda Red重组系统，进一步删除了另一个必需基因OPG158，从而构建出具有双重基因缺失、安全性更高的复制缺陷型MPXV（rdMPXV^△96,158）拯救系统。该病毒只能在稳定表达OPG96和OPG158的互补细胞系中完成复制周期。研究还利用了来自感染患者的MPXV毒株（GenBank: PP778666.1）以及市售化合物库进行高通量筛选。在机制探索方面，综合运用了透射电子显微镜（TEM）观察病毒形态、分析型超速离心（AUC）、质谱光度法（Mass Photometry）和小角X射线散射（SEC-SAXS）等生物物理技术分析蛋白寡聚化状态，并通过X射线晶体学解析了化合物与靶点蛋白的相互作用。动物实验则使用了重症联合免疫缺陷（SCID）小鼠和多产蹶鼠（dormice）模型来评估病毒毒力和化合物疗效。

组装缺失OPG96的MPXV基因组以产生复制缺陷型病毒颗粒

研究人员将完整的MPXV Clade IIb基因组划分为23个片段，并通过酵母TAR克隆技术，逐步将这些片段（除包含末端倒置重复序列的F1、F2外）与一个携带荧光报告基因（mGreenLantern-P2A-Gaussia luciferase）的酵母/大肠杆菌穿梭质粒pBAC进行组装，最终获得了缺失OPG96（M2R）基因的完整MPXV基因组质粒pBAC-MPXV^△96。将该质粒转染至预先感染了鸡痘病毒（FPV，以提供痘病毒转录酶）并稳定表达OPG96的CV-1细胞（CV-1-96）中，成功拯救出复制缺陷型MPXV颗粒（rdMPXV^△96）。实验证实，rdMPXV^△96只能在表达OPG96的互补细胞中有效复制并产生具有正常形态的病毒粒子，而在普通细胞中只能进行单轮感染，无法产生子代病毒，证明了其复制缺陷特性。

构建具有OPG96和OPG158双缺失的复制缺陷型MPXV颗粒

为了进一步提升安全性，研究团队利用CRISPR-Cas9结合Lambda Red重组系统，在已缺失OPG96的中间体质粒pBAC-I^△96的基础上，进一步删除了OPG158（A32.5L）基因，获得了双基因缺失的质粒pBAC-I^△96,158，并最终拯救出rdMPXV^△96,158病毒颗粒。该病毒只能在同时表达OPG96和OPG158的CV-1-96,158细胞中增殖。动物实验表明，rdMPXV^△96,158感染多产蹶鼠后不会导致体重下降，且在肺组织中检测不到病毒复制，而野生型MPXV感染则引起显著的体重减轻和高病毒载量，充分证明了rdMPXV^△96,158在体内的安全性。

rdMPXV^△96,158颗粒在细胞生物学和抗病毒评估中的应用

研究人员评估了rdMPXV^△96,158在不同细胞系中的感染效率，发现人永生化角质形成细胞（HaCaT）、非洲绿猴肾细胞（Vero E6）等对其高度易感。研究还证实，硫酸乙酰肝素和硫酸软骨素的生物合成关键基因B3GAT3对MPXV感染至关重要。利用该平台，他们验证了已知中和抗体（7D11）和抗病毒药物（特考韦瑞、西多福韦）的有效性，其结果与使用野生型病毒的报告一致，表明该平台可用于可靠的抗病毒评估。

利用rdMPXV^△96,158筛选抗病毒化合物

作为概念验证，研究团队使用rdMPXV^△96,158平台对一个包含3185个小分子化合物的库进行了高通量筛选。通过高内涵成像分析感染效率，他们鉴定出候选化合物G243-1720。该化合物对MPXV和疫苗病毒（VACV）等多种正痘病毒表现出强烈的抑制活性（EC₅₀在纳摩尔到微摩尔级别），且细胞毒性低（CC₅₀> 100 μM）。在SCID小鼠模型中，G243-1720通过腹腔或灌胃给药能显著降低肺部病毒滴度，显示出良好的体内抗病毒效果。

G243-1720抑制EEV的形成和病毒传播

机制研究表明，G243-1720与特考韦瑞类似，并不影响病毒进入、DNA复制、晚期基因表达以及细胞内成熟病毒（IMV）的形成，而是特异性地抑制细胞外包膜病毒（EEV）的产生和病毒的细胞间传播，导致病毒噬斑缩小。

G243-1720靶向MPXV的OPG57（F13）蛋白

为了阐明G243-1720的作用靶点，研究人员在递增的G243-1720浓度下连续传代rdMPXV^△96,158，筛选出了耐药病毒。基因组测序发现，耐药突变集中在OPG57（VACV F13L同源基因）蛋白的三个特定氨基酸位点：A290V、D294V和I372N。值得注意的是，这些位点同样是特考韦瑞和另一个已知OPG57抑制剂IMCBH的耐药突变位点。表达这些突变OPG57的病毒对G243-1720和特考韦瑞均表现出交叉耐药性，强烈提示G243-1720与特考韦瑞作用于相同的病毒靶蛋白。

G243-1720诱导OPG57蛋白二聚化

进一步的生物物理实验证实了上述猜想。分析型超速离心、质谱光度法和SEC-SAXS分析均表明，G243-1720能够诱导可溶性OPG57（sOPG57）发生二聚化，其作用方式与特考韦瑞高度相似。而上述耐药突变（A290V, I372N, D294V/I372N）则会显著削弱或完全消除G243-1720诱导二聚化的能力。晶体学分析也在特考韦瑞结合口袋处观察到了与G243-1720分子形状一致的额外电子密度，尽管由于分辨率限制未能完成精确建模，但综合证据表明G243-1720通过结合于特考韦瑞相同的口袋，诱导OPG57二聚，从而抑制病毒包膜和释放。

综上所述，本研究成功构建了一个安全、稳定的复制缺陷型MPXV平台（rdMPXV^△96,158），该平台能够在较低生物安全条件下（如BSL-2）模拟病毒生命周期的关键步骤，为MPXV的基础研究和抗病毒药物筛选提供了强大工具。利用此平台，研究者发现了新型抗痘病毒先导化合物G243-1720。尽管其化学结构不同于特考韦瑞，但G243-1720通过相同的机制——即靶向OPG57（F13）蛋白并诱导其二聚化——来抑制病毒传播。G243-1720对多种正痘病毒具有广谱抑制活性，并在小鼠模型中显示出良好的药代动力学特性和治疗效果。作为继IMCBH和特考韦瑞之后发现的第三个靶向OPG57的抑制剂，G243-1720因其新颖的化学结构和明确的作用机制，成为一个极具开发潜力的抗痘病毒候选药物，同时也凸显了rdMPXV平台在加速抗病毒发现方面的巨大价值。这项研究不仅为应对当前猴痘疫情提供了新的研发工具和候选疗法，也为未来应对其他痘病毒威胁奠定了重要基础。