FL7：一个古老且不依赖ABA的PP2C-As抑制剂在植物胁迫响应中的调控作用

《Nature Communications》：FL7 is an ancient ABA-independent inhibitor of PP2C-As regulating plant stress responses

本研究揭示了植物中一个不依赖脱落酸（ABA）的PP2C-A磷酸酶调控新机制。研究人员发现FORKED-LIKE 7（FL7）蛋白作为PP2C-As的广谱相互作用因子，通过其N端生长素管道化（AC）结构域以非竞争性方式抑制PP2C活性。该研究证实FL7通过抑制PP2C-As正向调节植物渗透胁迫耐受性和免疫反应，且这一功能在进化上可追溯至链型植物祖先，为培育抗逆作物提供了新靶点。

　　

随着气候变化加剧，土壤盐碱化和干旱频发，作物生长和抗病性面临严峻挑战。高盐度土壤尤其会增加植物对土传病原体的易感性，例如盐水灌溉会显著降低洋葱对尖镰孢菌的抗性，而营养液中高盐度栽培的番茄和菊花则表现出由寄生疫霉或隐地疫霉引起的病害严重度增加。这种现象部分归因于渗透胁迫条件下植物激素脱落酸（ABA）的积累，它会拮抗重要的防御激素水杨酸（SA）的作用。ABA处理可诱导拟南芥、番茄和大豆等不同植物的感病性，这凸显了植物渗透胁迫与防御响应之间存在复杂的交叉对话，但其潜在机制在很大程度上仍不清楚，这对开发气候适应性作物品种构成了相当大的挑战。

在进化过程中，植物形成了复杂的信号传导机制，以表现出适当的响应来抵御渗透和病原胁迫。这些胁迫响应通路的核心是蛋白质的可逆磷酸化，由蛋白激酶和蛋白磷酸酶的协调作用完成。其中，A类蛋白磷酸酶2C（PP2C-A）家族在调节植物胁迫信号网络中起着关键作用，并可能作为连接植物渗透和防御响应的枢纽。拟南芥编码9个PP2C-As，包括ABA不敏感1/2（ABI1/2）、对ABA高敏感1/2（HAB1/2）、高敏感萌发1/3（AHG1/3）和高ABA诱导1/2/3（HAI1/2/3）。所有这些酶都是功能性磷酸酶，是植物渗透胁迫响应的负调控因子。PP2C-As也负调控植物防御响应。例如，HAI1与促分裂原活化蛋白激酶3/6（MPK3/6）相互作用并使其去磷酸化，从而抑制MPK3/6的活化，导致植物免疫力减弱。ABI1也能与MPK6相互作用并使其去磷酸化。

PP2C-As缺乏调节亚基，因此其活性受到其他蛋白质的精确微调。PYR/PYL/RCAR蛋白（PYLs）是ABA信号通路的重要组成部分，是PP2C-As的已知调节因子。在ABA存在的情况下，PP2C-As与PYL-ABA形成复合物，其活性因而被抑制，从而释放出SnRK2s，诱导许多下游效应因子（如RD29B）的表达。除了PYLs，ABA共受体增强子1（EAR1）和ROP GTP酶ROP11可以增强一部分PP2C-As的活性。PP2C-A磷酸酶活性的直接抑制因子也已被鉴定，如RNA解旋酶RH8和血红素结合蛋白DOG1分别与AHG3和AHG1物理结合并抑制其活性。尽管已鉴定出许多PP2C-A的酶活性调节因子，但这些调节因子仅对几个特定的PP2C-As起作用。除了PYLs，是否还有其他广谱调节因子靶向多个PP2C-As仍属未知。

FORKED-LIKE（FL）蛋白家族的特征是拥有一个N端生长素管道化（AC）结构域和一个C端pleckstrin同源性样（PH）结构域。这些蛋白最初被发现通过介导生长素外排蛋白PINFORMED1（PIN1）的不对称定位参与叶脉发育。近期研究揭示了FL蛋白在植物生物学中的其他功能。本研究团队发现FL7转录本存在于多种植物组织中，其蛋白定位于细胞核和细胞质。进一步研究发现，FL7直接与HAI1/2/3相互作用并抑制其磷酸酶活性，从而阻止MPK3/6的去磷酸化，进而促进植物免疫力。这一发现促使我们研究FL7是否像PYLs一样，作为PP2C-As的通用酶抑制剂。

本研究提供了证据表明FL7在拟南芥中作为PP2C-As的广谱抑制剂，因而是植物ABA响应和渗透耐受性的正调控因子。重要的是，盐胁迫通常会损害植物对病原体的抗性，但我们发现FL7过表达系对盐胁迫的抗性增强。与PYLs不同，FL7以不依赖ABA和非竞争性的方式抑制PP2C-A活性。与这些发现一致的是，FL7以不依赖ABA的方式正向调节渗透响应。FL7通过其保守结构域直接与PP2C-A的C端磷酸酶结构域结合，从而有效抑制PP2C-A磷酸酶活性。进化分析表明，FL7及其同源物存在于Klebsormidiophyceae藻类和陆地植物的共同祖先中，并在链型植物谱系中扩展。来自Klebsormidium nitens的KnFL7和来自Chara braunii的CbFL7具有PP2C-A抑制活性，并表现出与AtFL7相似的功能。这些结果表明，FL7代表了一个在绿色植物中保守的古老PP2C-A抑制剂家族，其出现早于PYLs，并可能整合植物的生物和非生物胁迫响应。

本研究发表在《Nature Communications》杂志上。为开展此项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。研究材料主要为拟南芥（Arabidopsis thaliana）哥伦比亚生态型（Col-0）及其各种突变体和转基因株系。关键实验技术包括：分子互作验证技术，如酵母双杂交（Y2H） assay、免疫共沉淀（Co-IP） assay和GST pull-down assay；体外酶活分析，使用Ser/Thr磷酸酶检测试剂盒测定PP2C活性；蛋白质磷酸化状态分析，通过体外激酶 assay和蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测MPK6和SnRK2.6的磷酸化水平；遗传学分析，通过CRISPR-Cas9技术构建多基因突变体，并进行表型分析（如种子萌发、根长、气孔开度、干旱耐受性、离子渗漏测定）；功能互补实验，将藻类FL7同源基因在拟南芥fl7突变体中表达；进化分析，对来自17个代表性植物物种的FL蛋白进行基因组和系统发育分析；以及转录组学分析（RNA-seq），对经甘露醇处理的幼苗进行测序，分析差异表达基因（DEGs）。

FL7广泛与PP2C-As相互作用并抑制其磷酸酶活性

研究人员通过酵母双杂交和免疫共沉淀实验发现，FL7能够与所有其他六个PP2C-A成员相互作用。利用pFL7::gFL7-FLAG fl7互补系（gFL7）进行免疫沉淀，使用α-ABI1/ABI2抗体可在沉淀物中检测到ABI1和ABI2蛋白。Pull-down实验进一步证实了FL7与PP2C-As之间的直接相互作用。此外，磷酸酶活性测定结果显示，FL7能抑制ABI1、ABI2、HAB2和AHG3 23%至56%的活性，但对D类酶无抑制作用。对PP2C-A N端截短突变体（去除自抑制结构域）的实验表明，FL7不依赖于其自抑制结构域直接抑制PP2C-A活性。体内实验显示，与野生型相比，FL7过表达系的总PP2C活性显著降低，而fl7突变体的活性最高。这些生化数据证实FL7在体内外均作为PP2C-As的广谱酶抑制剂。

FL7抑制PP2C-As介导的MPK6和SnRK2.6去磷酸化

进一步实验表明，FL7能够抑制PP2C-A对其底物的去磷酸化作用。磷酸化的MPK6可被ABI1去磷酸化，而加入FL7（而非GST对照）后，MPK6的去磷酸化得到显著恢复。同样，SnRK2.6的磷酸化水平在ABI1存在下大大降低，但加入FL7后这种现象被逆转，表明FL7在体外抑制了ABI1对SnRK2.6的去磷酸化。在snrk2.2/3/6三突变体原生质体中进行双荧光素酶报告基因检测证实，FL7（以及作为阳性对照的PYL10）能够恢复被ABI1和AHG3抑制的由SnRK2.6诱导的pRD29B-LUC报告基因表达。

FL7正向调节植物渗透胁迫响应

为了研究FL7作为PP2C-As抑制剂的功能，研究人员基于总PP2C-A活性与ABA响应之间的拮抗效应，测试了FL7相关基因型的ABA敏感性。在无ABA情况下，fl7突变体和FL7过表达系（OE-FL7）在萌发率或初生根长方面与野生型无显著差异。然而，ABA处理增加了fl7突变体的萌发率和初生根生长，而OE-FL7幼苗则表现出ABA超敏感性。类似地，ABA诱导的气孔关闭在fl7突变体中受损，但在OE-FL7系中增强。这些结果表明FL7可能通过抑制总PP2C-A活性来正向调节植物ABA响应。

由于PP2C-As是植物渗透响应的重要负调控因子，研究人员接着探讨了FL7在植物渗透耐受性中的作用。在正常条件下，所有拟南芥株系生长相似。干旱20天后，fl7突变体存活率最低，而OE-FL7系存活率显著增加，表明FL7正向调控耐旱性。离体叶片失水速率在fl7突变体中更快，在OE-FL7系中减弱。RNA测序（RNA-seq）分析显示，在300 mM甘露醇处理12小时后，OE-FL7系中许多渗透响应标记基因（如ABI1/2, RD29B, RAB18）的诱导表达最强，Col-0中中等，fl7突变体中最弱，表明FL7正向调节植物渗透响应。

FL7过表达系增强的病原抗性不受盐胁迫损害

FL7也是植物免疫的正调控因子。结合其在渗透响应中的作用，表明FL7是渗透响应和防御响应的正枢纽调控因子。研究发现FL7通过电解质渗漏测定促进植物对NaCl引起的盐胁迫的耐受性。NaCl诱导的SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6磷酸化在fl7突变体中减少，在OE-FL7系中增加。FL7蛋白水平在NaCl处理后升高。模拟土壤盐渍化后，野生型、fl7突变体和gFL7互补系对辣椒疫霉（Phytophthora capsici）的感病性显著增加，这与先前发现一致。有趣的是，在OE-FL7系中，无论是否经NaCl处理，均未检测到明显的病斑面积变化，表明盐胁迫引起的感病性增强在OE-FL7系中大大降低。

fl7与pp2c-As突变体的遗传分析

为了进一步分析FL7与PP2C-As之间的遗传关系，研究人员利用CRISPR-Cas9技术在abil hab1 pp2ca三突变体中敲除FL7，产生了abil hab1 pp2ca fl7四突变体。abil hab1 pp2ca三突变体在种子萌发和根生长中对ABA敏感。虽然fl7与野生型相比表现出降低的ABA敏感性，但abil hab1 pp2ca fl7四突变体表现出与abil hab1 pp2ca三突变体相当的表型。类似地，耐旱性分析显示，abil hab1 pp2ca fl7四突变体表现出与abil hab1 pp2ca三突变体相当的表型，两者均表现出增强的耐旱性。这些结果表明FL7的功能主要依赖于PP2C-As。

FL7以不依赖ABA和非竞争性方式抑制PP2C-As

磷酸酶活性测定表明FL7的抑制功能不依赖ABA，这与典型的PYLs不同。微尺度热泳动（MST）结合实验显示PYL10与ABA有相互作用，但FL7和GST对照对ABA没有结合亲和力。ABA不影响FL7-ABI1的结合。酶学分析证明ABA增强了PYL10介导的但对FL7介导的ABI1抑制没有影响。当使用ABI2和AHG3时，也观察到类似的不依赖ABA的抑制活性。此外，ABA并未增强FL7抑制ABI1介导的SnRK2.6去磷酸化的能力。这些结果表明FL7对PP2C-As的抑制活性不依赖于ABA。

为了阐明FL7和PYL10抑制活性的生化机制，研究人员进行了酶动力学分析。竞争性抑制剂与底物竞争酶的活性位点，抑制在底物饱和时可逆。而非竞争性抑制剂改变活性位点构象或化学性质，以独立于底物水平的方式减少底物结合/催化。实验结果表明，尽管存在ABA，PYL10对ABI1的抑制在底物饱和时可逆，而FL7介导的抑制对增加的底物可用性和ABA处理均无响应。AHG3也出现相同的模式，证实了FL7的非竞争性抑制机制。

FL7通过不依赖ABA的途径增强植物渗透胁迫耐受性

为了研究FL7是否不依赖ABA调节植物渗透响应，研究人员将ABA缺陷型aba1-1突变体与fl7杂交，产生fl7 aba1-1双突变体。研究发现，在无ABA情况下，aba1-1的气孔比fl7和Col-0更开放，而fl7 aba1-1双突变体的气孔开度最大。耐旱性测定显示，与aba1-1单突变体相比，fl7 aba1-1双突变体存活率更低。这些结果进一步支持FL7以不依赖ABA的方式抑制PP2C-A活性并正向调节植物渗透响应。

PYLs作为ABA受体和PP2C-As的广谱抑制因子。为了检验FL7和PYLs之间的关系，研究人员使用了ABA拮抗剂1（AA1），它是一种能阻断所有PYR/PYL-PP2C相互作用的广谱拮抗剂。分析显示，添加AA1显著提高了Col-0的萌发率，表明成功抑制了PYL活性。值得注意的是，fl7+AA1的萌发率高于Col-0+AA1，表明即使PYL活性被阻断，FL7仍继续调节PP2C通路。此外，研究发现PYL和FL7同时存在时，对ABI1磷酸酶活性的抑制比任一成分单独存在时更强，表明存在叠加效应。这些数据支持FL7和PYLs在平行通路中发挥作用。

FL7通过N端生长素管道化结构域抑制PP2C活性

FL7蛋白包含一个N端生长素管道化结构域（AC）和一个C端pleckstrin同源性样结构域（PH）。为了研究FL7的哪个结构域对PP2C-As的抑制活性至关重要，研究人员构建了FL7截短突变体（FL7N和FL7C）。Y2H实验结果表明，AC结构域（而非PH结构域）足以与测试的PP2C-As的磷酸酶结构域相互作用。类似地，AC结构域足以抑制ABI1和AHG3的活性。酶动力学分析显示FL7N以非竞争性方式抑制ABI1。遗传互补实验表明，在fl7突变体背景下，表达FL7的AC结构域（而非PH结构域）完全回补了fl7突变体降低的ABA敏感性表型，而过表达AC结构域则模拟了OE-FL7系的表型。与OE-FL7系相比，OE-FL7N系的蛋白提取物也表现出受损的PP2C活性。这些结果表明AC结构域足以抑制PP2C活性。

FL7出现于古老的链型植物中

为了探究FL7的保守性，研究人员对17个代表性植物物种基因组中的AC结构域进行了比较基因组学和系统发育分析。除了陆地植物支系，在链型藻类Klebsormidiophyceae和Charophyceae中发现了FL7的同源物，但在Coleochaetophyceae、Zygnematophyceae、Mesostigmatophyceae和Chlorokybophyceae支系中未发现。系统发育分析显示这些蛋白与陆地植物FL7同源物形成一个单系群。FL7同源物的拷贝数在藻类和苔藓植物中较低，但在维管植物中扩展。PYLs起源于Zygnematophyceae和陆地植物的共同祖先，可能通过水平基因转移从土壤细菌获得。有趣的是，在Klebsormidiophyceae中鉴定到FL7同源物，表明它们出现于Klebsormidiophyceae和Phragmoplastophyta的最后共同祖先（LCA）中，该祖先可能生活在超过十亿年前。这些发现表明FL7同源物可能是比PYLs更古老的PP2C抑制剂。

FL7功能在十亿年链型植物进化中保守

PYLs是Zygnematophyceae和陆地植物共同祖先的进化创新。有趣的是，进化分析显示，与PYLs相比，FL7同源物是更古老的PP2C抑制剂。为了研究它们在链型植物中的保守功能，研究人员合成了来自Klebsormidium nitens和Chara braunii的FL7。Y2H和Pull-down实验证实KnFL7和CbFL7都能与AtABI1相互作用。体外磷酸酶活性测定显示，与AtFL7类似，KnFL7和CbFL7显著抑制AtABI1的磷酸酶活性。研究人员构建了在AtFL7启动子控制下表达藻类FL7的转基因植物，并导入fl7突变体。与野生型相比，互补系表现出相似的渗透响应。因此，结果表明FL7是一个在十亿年链型植物进化中功能保守的PP2C-A抑制剂。

结论与讨论

本研究鉴定出FL7作为一个广谱PP2C-A相互作用因子，通过其N端AC结构域直接抑制PP2C-A活性。有趣的是，FL7的抑制功能在两个方面不同于PYLs：FL7对PP2C-A的抑制不依赖ABA并以非竞争性方式发生。此外，FL7以不依赖ABA的方式正向调节渗透耐受性。FL7过表达系对病原体高度抗病，且这种抗性不受渗透胁迫损害。最后，研究发现FL7是一个保守的PP2C抑制剂，出现于十亿多年前。来自链型藻类的FL7同源物在拟南芥中具有相似功能。

土壤盐渍化是由于不当灌溉实践和气候变化而日益严重的全球性问题。此类环境变量对植物的影响可能对植物病害发展产生负面影响。识别整合渗透胁迫和防御响应的关键调控因子有助于开发适应气候变化的抗逆作物。本研究表明，过表达PP2C-As抑制剂FL7有助于植物适应非生物和生物胁迫。更重要的是，FL7过表达可防止盐胁迫下植物免疫力受损，表明FL7可能是改善盐碱条件下植物防御响应的良好遗传资源。由于内源FL7在盐度下也会积累但其抗性仍受损，推测盐度胁迫前高水平的FL7积累对于在盐度下赋予病原体抗性可能至关重要。未来的研究应侧重于微调FL7蛋白水平，以在盐度下促进病原体抗性，同时避免潜在的副作用。这些发现突出了抑制负枢纽调控因子（如PP2C-As）在植物响应生物和非生物胁迫中的策略，可能有助于开发适应气候变化引起的波动环境的作物。

有趣的是，FL7以不依赖ABA的方式抑制PP2C-As。除了ABA依赖途径，ABA不依赖途径是植物重要的适应机制。例如，ahg1-1突变体在成年植物中没有ABA相关表型。AHG1的这种功能可能源于其与PYLs相互作用表面的特异性，导致它仅与RCAR1-3相互作用。尽管ABA结合的RCAR1-3与AHG1相互作用，但它仅微弱抑制AHG1活性。与PYLs不同，DOG1能与AHG1相互作用并在ABA通路平行地抑制其活性。本研究发现FL7以不依赖ABA的方式抑制PP2C-As，并且FL7也与AHG1相互作用，表明FL7以与PYLs不同的方式与PP2C-As相互作用。这一假设可进一步通过FL7以非竞争性方式抑制PP2C-As和渗透耐受性得到证明，这也不同于PYLs的活性。重要的是，在ABA缺陷的aba1-1突变体中突变FL7进一步削弱了aba1-1受损的渗透耐受性，表明FL7参与了ABA不依赖的渗透响应。

植物如何适应陆地生活是一个长期存在的问题。PP2C-A调控通路的进化被认为是植物适应陆地环境的关键一步。PP2C-As在所有链型植物物种（包括Klebsormidiophyceae和Charophyceae等藻类）中表现出高度的功能保守性。然而，PYLs起源于Zygnematophyceae和胚珠植物的共同祖先，并通过水平基因转移从土壤细菌获得。这就提出了一个问题：缺乏PYL系统的古老藻类（如K. nitens和C. braunii）如何调节PP2C-A活性以应对渗透胁迫？本研究显示FL7是整个链形植物门中保守的PP2C-A抑制剂，并且来自K. nitens和C. braunii的FL7同源物也表现出PP2C-A抑制能力，表明FL7同源物是古老的PP2C-A调节因子，可能被早期藻类用来调节PP2C-A活性和适应渗透胁迫。这一假设可通过未来研究这些藻类中FL7同源物的生物学功能来验证。此外，FL7同源物在植物陆地化过程中扩展。值得注意的是，用通用PYL抑制剂AA1处理fl7突变体进一步损害了ABA敏感性，表明即使PYL活性被阻断，FL7仍继续调节PP2C通路。这些发现表明FL7-PP2C模块可能代表了植物陆地适应中与ABA-PYL通路平行的另一个重要调控分支，并可能帮助植物调节ABA不依赖的PP2C-A调控通路。

FL家族在陆地植物进化过程中扩展。在拟南芥中，FL7是九个FKD1/FL蛋白之一。其他FLs也包含AC结构域，因此可能也是PP2C-A抑制剂。FLs之间可能存在功能冗余。FLs可能与PP2C-As相互作用形成复杂网络，从而可能促进对大量生理发育过程和环境胁迫的响应。阐明这一网络需要未来大量的研究。

总之，本研究数据表明FL7同源物代表了一个在整个绿色植物中保守的古老PP2C-A抑制剂家族，并整合了植物的生物和渗透响应。