scRepli-RamDA-seq：实现S期基因表达动态分析的单细胞多组学新技术

《Nature Communications》：scRepli-RamDA-seq: a multi-omics technology enabling the analysis of gene expression dynamics during S-phase

　　

单细胞测序技术大大推进我们对细胞类型多样性和异质性的了解。然而，现有的单细胞多组学方法无法监测S期（DNA合成期）的基因表达动态变化。

传统方法通常只能以相对较低的分辨率（0.25-1.0 Mb）检测DNA拷贝数变异（CNV），且多数仅能捕获poly(A) RNA，而忽略了在多种情况下发挥重要作用的非poly(A) RNA。这些技术瓶颈严重限制了我们对细胞周期调控等基础生物学过程的理解。

在这一背景下，日本理化学研究所（RIKEN）和三重大学领导的研究团队开发出一种名为单细胞Repli-RamDA-seq（scRR-seq）的多组学方法，能够在同一细胞中实现高分辨率DNA复制分析和全长总RNA测序。

这项技术于12月15日发表在《Nature Communications》杂志上。它巧妙整合了团队先前开发的两项技术：单细胞DNA复制测序（scRepli-seq）和单细胞随机置换扩增测序（scRamDA-seq）。

研究人员通过优化磁珠分离技术，实现了同一单细胞中基因组DNA和总RNA的高效分离。DNA组分采用基于简并寡核苷酸引物PCR的全基因组扩增策略，而RNA组分则利用非随机引物和链置换扩增技术，实现了包括非poly(A) RNA在内的全长转录本覆盖。他们还建立了scRR1和scRR3两个版本，分别适用于大规模实验和珍贵样本处理。

在人视网膜色素上皮细胞（hTERT-RPE1）和小鼠胚胎干细胞（CBMS1 mESC）中的基准测试显示，scRR-seq生成的DNA复制时序图谱分辨率达40 kb，与单独使用scRepli-seq的结果高度一致；RNA测序可检测约80%的scRamDA-seq靶基因，包括非poly(A) RNA（如RN7SK、MALAT1），且转录本均匀覆盖。

之后，研究人员利用scRR-seq-DNA构建了完整S期的转录图谱，成功捕获了hTERT-RPE1细胞和CBMS1 mESC在S期的基因表达动态。通过广义加性模型（GAM）拟合，他们在hTERT-RPE1中鉴定出52个显著动态基因，在CBMS1 mESC中鉴定出55个基因，这些基因显著富集在细胞分裂相关过程中。

利用单核苷酸多态性（SNP）信息，scRR-seq首次实现了单细胞水平的单倍型复制时序和基因表达分析。在hTERT-RPE1细胞中，他们鉴定出X染色体失活单倍型（Xi）的晚期复制特征，以及14个X连锁单等位基因表达基因；在CBMS1 mESC中，他们证实了复制时序异步性与等位基因表达失衡的正相关关系——早期复制的单倍型往往表达水平更高。

在分析人单倍体细胞（HAP1）后，研究人员发现早期复制结构域的基因表达水平显著高于中晚期结构域，但DNA拷贝数（1个拷贝 vs 2个拷贝）对基因表达的影响有限：仅约8.9%的剪接RNA和6.9%的未剪接RNA表现出显著表达差异，表明哺乳动物S期转录组具有稳定性，基因表达主要受染色质状态而非拷贝数变化调控。

在低剂量阿非迪霉素处理的人成纤维细胞（IMR-90）中，scRR-seq成功检测到50 kb分辨率的CNV，包括>20 Mb的大片段异常，并发现CNV与基因表达的关联具有复杂性——部分CNV区域基因表达无显著变化，而部分3-拷贝区域表达升高、1-拷贝区域表达降低，提示单凭RNA-seq不足以推断染色体异常。

scRepli-RamDA-seq通过整合高分辨率DNA复制分析和全长RNA测序，解决了现有单细胞多组学技术在S期研究中的关键局限，实现了同一细胞中基因组复制动态与转录组特征的同步解析。

这项技术不仅在数据质量上超越现有方法，还具有单倍型分辨能力、CNV检测灵敏度高、流程简便等优势，为探索细胞周期调控、基因组不稳定性与基因表达的关联提供了强大工具。