胆固醇响应性肝源tRNA衍生小RNA tsRNA-Glu-CTC调控胆固醇稳态与动脉粥样硬化的新机制

《Nature Communications》：A cholesterol-responsive hepatic tRNA-derived small RNA regulates cholesterol homeostasis and atherosclerosis development

本研究针对胆固醇代谢调控机制存在的认知空白，发现了一种新型调控因子——肝富集tsRNA-Glu-CTC。通过PANDORA-seq技术鉴定出该RNA是肝脏中最丰富的tsRNA，实验证实其能响应胆固醇水平变化。功能研究表明，过表达tsRNA-Glu-CTC会诱发高胆固醇血症和脂肪肝，而敲低则能缓解饮食诱导的代谢异常。机制上，tsRNA-Glu-CTC通过与SREBP2蛋白相互作用，经E-box基序激活Srebp2转录，形成正反馈循环。研究人员进一步通过MLC-seq技术解析了内源性tsRNA-Glu-CTC的RNA修饰谱，发现修饰后的tsRNA具有更强生物活性。该研究为心血管代谢疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在人体复杂的代谢网络中，胆固醇如同一位重要的建筑师，既是细胞膜的关键组成部分，又是多种激素和胆汁酸的前体。然而，这位建筑师的水平必须精确控制——过多会导致动脉壁上形成斑块，引发动脉粥样硬化；过少又会影响正常的生理功能。长期以来，科学家们已经发现了一系列调控胆固醇平衡的关键因子，其中固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）被公认为胆固醇合成的“总指挥”，调控着HMG-CoA还原酶（HMGCR）和PCSK9等关键基因的表达。

除了这些传统的蛋白质调控因子，小非编码RNA（sncRNA）的世界同样精彩。其中，微小RNA（miRNA）家族成员如miRNA-33、miRNA-148和miRNA-122已被证明在胆固醇代谢中扮演重要角色。然而，这些只是冰山一角。随着测序技术的进步，科学家们发现了一类新型的小RNA——转运RNA衍生的小RNA（tsRNA），它们可能隐藏着更多调控代谢的秘密。

传统的RNA测序方法存在一个技术瓶颈：tsRNA通常带有丰富的化学修饰，这些修饰会干扰测序过程，使得大部分tsRNA在常规分析中“隐身”。直到PANDORA-seq技术的出现，这一局面才得以改变。这种先进的测序方法能够消除RNA修饰带来的干扰，揭示出真实的sncRNA图谱。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，科学家们应用PANDORA-seq技术深入探索了小鼠肝脏中的sncRNA世界，意外发现tsRNA-Glu-CTC是肝脏中最丰富的tsRNA，其表达量甚至超过了著名的肝脏富集miRNA——miRNA-122。更令人惊讶的是，这种小RNA竟然能够响应胆固醇水平的变化，当胆固醇升高时，它的表达会下降，反之则上升。

为了探究tsRNA-Glu-CTC的生物学功能，研究人员进行了一系列实验。他们给小鼠注射合成的tsRNA-Glu-CTC寡核苷酸，结果发现这些小鼠出现了高胆固醇血症和肝脏脂肪变性。相反，当使用反义寡核苷酸（ASO）敲低tsRNA-Glu-CTC后，小鼠即使食用高胆固醇饮食，也能免受高胆固醇和动脉粥样硬化的困扰。

机制探索揭示了一个精巧的调控回路：tsRNA-Glu-CTC能够进入细胞核，与SREBP2蛋白协作，通过Srebp2基因启动子区的E-box基序，促进其自身转录。这种正反馈机制如同一个放大器，增强了胆固醇合成通路的活动。

RNA修饰是另一个迷人的层面。通过质谱阶梯互补测序（MLC-seq）技术，研究人员解析了内源性tsRNA-Glu-CTC的修饰谱，发现其在第6位核苷酸有m²G修饰，第19和20位有双氢尿苷（D）修饰。重要的是，带有这些天然修饰的tsRNA-Glu-CTC比合成版本具有更强的生物活性，仅需百分之一的剂量就能产生显著的代谢效应。

这项研究不仅发现了一个新的胆固醇代谢调控因子，还揭示了tsRNA通过RNA修饰和转录调控等非经典机制影响生理功能的新范式，为心血管代谢疾病的治疗提供了新的思路和靶点。

主要技术方法

本研究采用了多种前沿技术方法：通过PANDORA-seq技术克服RNA修饰干扰，全面分析小鼠肝脏小非编码RNA图谱；利用Northern blot验证tsRNA表达；使用反义寡核苷酸进行体内功能获得和缺失实验；通过RNA测序和生物信息学分析差异表达基因；采用报告基因实验和染色质免疫沉淀分析启动子活性；运用MLC-seq技术鉴定内源性tsRNA的位点特异性RNA修饰；通过RNA pulldown和蛋白质互作实验研究tsRNA与蛋白质的相互作用。人类队列样本来自17名健康受试者。

tsRNA-Glu-CTC是肝脏中最丰富的tsRNA

研究人员通过PANDORA-seq技术发现，与传统RNA测序结果显示miRNA占主导不同，小鼠肝脏中实际上含有更丰富的tsRNA和rRNA衍生小RNA（rsRNA）。其中，tsRNA-Glu-CTC是最主要的tsRNA物种，占检测到的tsRNA总量的65%以上。Northern blot分析证实，tsRNA-Glu-CTC在肝脏中的表达水平甚至超过了著名的肝脏富集miRNA——miRNA-122。这种小RNA不仅在肝脏表达，也在肠道、脾脏、肺和脂肪组织中有分布。

tsRNA-Glu-CTC响应胆固醇水平变化

当给野生型小鼠喂食高胆固醇饮食（HCD）时，肝脏中的tsRNA-Glu-CTC表达显著下降，而其他tsRNA如tsRNA-Ser-GCT和tsRNA-Leu-CAG则不受影响。在体外实验中，用乙酰化LDL处理人肝细胞系HepG2细胞模拟胆固醇负荷条件，同样降低了tsRNA-Glu-CTC表达；相反，使用辛伐他汀消耗胆固醇则增加了其表达。这表明tsRNA-Glu-CTC是一个胆固醇响应性的tsRNA。机制上，高胆固醇饮食可能通过降低血管生成素（ANG）的表达来影响tsRNA的生物合成。

tsRNA-Glu-CTC调控胆固醇稳态

功能实验显示，给小鼠注射合成的tsRNA-Glu-CTC寡核苷酸会导致高胆固醇血症和肝脏脂肪变性，血清总胆固醇和LDL胆固醇水平显著升高，肝脏脂质积聚增加。相反，在高胆固醇饮食喂养的小鼠中使用tsRNA-Glu-CTC ASO进行敲低，则能降低血清胆固醇水平，改善肝脏脂肪变性。在动脉粥样硬化易感的Ldlr^-/-小鼠模型中，tsRNA-Glu-CTC ASO治疗还能减轻动脉粥样硬化病变。

tsRNA-Glu-CTC通过SREBP2调控脂质生成基因

RNA测序分析发现，tsRNA-Glu-CTC过表达导致449个基因差异表达，其中186个上调，263个下调。基因本体生物学过程分析显示，这些基因显著富集在“胆固醇生物合成过程”、“脂质生物合成过程”和“SREBP信号通路”等代谢相关通路。特别是SREBP2及其靶基因HMGCR和PCSK9的表达均被tsRNA-Glu-CTC上调。Western blot验证了SREBP2前体蛋白和核形式蛋白水平的增加。

tsRNA-Glu-CTC通过E-box基序调控SREBP2转录

机制研究表明，tsRNA-Glu-CTC在肝细胞中既存在于细胞质也存在于细胞核。报告基因实验发现，tsRNA-Glu-CTC能激活包含E-box元件的Srebp2启动子。当突变E-box后，这种激活作用消失。RNA pulldown实验证实tsRNA-Glu-CTC能与核SREBP2蛋白相互作用，染色质免疫沉淀进一步显示SREBP2能被招募到自身启动子的E-box区域。这些结果表明tsRNA-Glu-CTC与SREBP2形成复合物，通过E-box基序协同调节Srebp2的转录。

tsRNA-Glu-CTC的RNA修饰增强其功能

研究人员通过MLC-seq技术鉴定了内源性tsRNA-Glu-CTC的位点特异性修饰：第6位核苷酸有m²G修饰，第19和20位有D修饰。这些修饰与其前体tRNA-Glu-CTC的修饰相同。功能上，从小鼠肝脏分离的内源性tsRNA-Glu-CTC（带有天然修饰）比合成版本活性强得多，仅需0.006 mg/kg的极低剂量就能显著提高血清胆固醇水平和肝脏脂质积聚，而相同剂量的合成tsRNA则无此效应。

tsRNA-Glu-CTC与人类胆固醇水平相关

在人类研究中，研究人员检测了17名健康受试者血块中的tsRNA-Glu-CTC表达，发现其与血清胆固醇水平呈正相关。这表明tsRNA-Glu-CTC在人类胆固醇代谢中可能同样发挥作用，为其临床相关性提供了初步证据。

研究结论与意义

本研究系统阐明了tsRNA-Glu-CTC作为胆固醇代谢新型调控因子的重要作用。这一肝脏富集的tsRNA不仅能响应胆固醇水平变化，更通过与其靶蛋白SREBP2的相互作用，形成正反馈循环，放大胆固醇合成信号。值得注意的是，内源性tsRNA-Glu-CTC的RNA修饰对其功能至关重要，这揭示了RNA修饰在代谢调控中的新层面。

从转化医学视角看，tsRNA-Glu-CTCASO在动物模型中展现出的抗动脉粥样硬化效果，为心血管代谢疾病的治疗提供了新策略。与传统靶向蛋白质的策略不同，靶向tsRNA可能开启一类全新的治疗方法。此外，研究中建立的PANDORA-seq和MLC-seq技术平台为发现更多“隐藏”的调控RNA及其修饰功能提供了有力工具。

这项研究不仅拓展了我们对非编码RNA世界的认知，也揭示了tsRNA作为代谢疾病新型生物标志物和治疗靶点的潜力。随着对tsRNA功能机制的深入研究，未来可能涌现出更多针对心血管代谢疾病的创新治疗策略。