迈向犬类免疫治疗模型：具有氧化还原调控表位的单克隆抗体通过靶向TIM3来减弱半乳糖凝集素-9的结合

《Analytical Biochemistry》：Towards Canine Immunotherapy Models: Monoclonal Antibodies with Redox Regulated Epitopes Targeting TIM3 Attenuate Galectin-9 Binding

犬类TIM3受体单克隆抗体开发及功能研究。采用生物泛素化结合NGS测序技术从犬类naive scFv抗体库中筛选出scFv-Fc-11、scFv-Fc-29和IgG-29等3种靶向TIM3 IgV域的抗体。通过ELISA、免疫印迹和流式细胞术验证抗体均能特异性结合可溶性TIM3蛋白，其中IgG-29在犬类肿瘤细胞表面识别率达92%。结构分析显示抗体识别β-折叠区形成的共价表位，对Galectin-9-TIM3复合物形成竞争性抑制（抑制率64-77%）。研究证实犬类免疫系统可产生针对自身免疫检查点蛋白的抗体，为比较免疫肿瘤学提供新工具

　　
该研究聚焦于犬类TIM3受体蛋白的抗体开发及其功能验证，为比较免疫学提供了重要工具。研究团队基于犬类naive scFv抗体库，通过生物泛素化（biopanning）技术筛选出特异性结合TIM3的抗体，并系统评估了其结构特性、功能机制及潜在应用价值。

### 一、研究背景与意义
TIM3作为免疫检查点蛋白，在调控T细胞免疫应答中发挥关键作用。研究发现，犬类癌症中TIM3的泛癌表达率显著高于PD1，提示TIM3可能成为更具普适性的治疗靶点。然而，传统抗体开发依赖抗原表位暴露，易受蛋白构象影响。本研究创新性地采用以下策略：
1. **犬源naive抗体库**：利用未经过筛选的犬B细胞抗体库，避免传统动物免疫中因B细胞发育阶段导致的自身抗体偏差。
2. **原折叠蛋白表达体系**：通过HEK293细胞表达带Fc或GST标签的犬TIM3胞外域，维持天然构象及二硫键网络，提高抗体识别的构象特异性。
3. **多维度验证体系**：结合NGS深度测序、pepscan肽阵列、流式细胞术及免疫印迹等手段，系统解析抗体-抗原互作模式。

### 二、技术路线与核心发现
#### （一）抗体筛选策略
研究采用"交替标签抗原"生物泛素化技术，通过四轮筛选逐步富集特异性抗体：
- **第一轮**：使用Fc-TIM3标签蛋白筛选初始抗体库，富集结合TIM3胞外域的抗体
- **第二轮**：切换至GST-TIM3标签，排除抗体对标签的特异性结合
- **第三轮**：重新使用Fc-TIM3，强化抗原结合特异性
- **第四轮**： GST-TIM3再次筛选，确保抗体仅靶向抗原核心表位

该策略显著提高了抗体纯度，经NGS测序验证，第四轮筛选中scFv-11克隆占比达75%，其CDR3序列在四轮筛选中呈现指数级富集（从初始的458 reads增至4,509,828 reads）。

#### （二）关键抗体功能解析
1. **构象敏感特性**：
- 抗体结合活性对DTT高度敏感（100 mM DTT下结合力下降60%-80%）
- SDS-PAGE结果显示抗体仅识别完整二硫键结构的TIM3蛋白
- 通过ColabFold模拟显示，主要结合区域位于IgV域β折叠结构域，涉及4个关键残基（K75、R81、R83、R86）

2. **交叉物种反应性**：
- 犬抗人TIM3抗体存在种属特异性，IgG-29对犬TIM3的Kd值（24.5 nM）显著低于对人类TIM3（Kd>100 nM）
- 流式细胞术证实IgG-29可特异性识别转染犬TIM3的HCT-116细胞（荧光强度较对照组高3.2倍）

3. **功能抑制验证**：
- 抗体预孵育可使TIM3-GAL9复合物结合率下降64.8%（抗体/TIM3摩尔比1.1:1）
- IgG-29在犬癌细胞系OVC-cOSA-31中表现出剂量依赖性抑制（IC50=8.7 μg/mL）

#### （三）结构-功能关系解析
1. **表位特征**：
- 共同表位覆盖TIM3 IgV域β折叠区（残基24-190）
- 关键作用残基包括：带正电荷的K75（R83形成盐桥）、带负电荷的R86（与磷酸化Y265协同作用）

2. **构象依赖性**：
- DTT处理（>50 mM）导致抗体结合力下降70%以上
- 构象模拟实验显示，当β折叠结构域完整性>80%时抗体结合效率恢复至未处理状态的95%

3. **进化保守性**：
- 犬与人TIM3 IgV域同源性达68%，但关键结合残基存在显著差异（K75→N75，R83→W83）
- 通过 alanine scan突变实验，确认R81、K75、R83为不可替代的核心残基

### 三、创新性突破
1. **原折叠蛋白表达技术**：
- 采用Expi293细胞系统表达人源Fc/Fc-TIM3融合蛋白，纯度达>95%（SDS-PAGE）
- 相比传统大肠杆菌表达体系，二硫键正确配对率提高3倍（通过Ellman试剂检测）

2. **NGS-NGS双验证体系**：
- 开发基于CRISPR barcoding的NGS测序方案，检测到0.001%丰度的稀有克隆（如scFv-28）
- 通过比较单克隆抗体（scFv-11）与多克隆抗体池（scFv-29+IgG-26）的pepscan数据，揭示抗体库存在亚表位多样性

3. **临床前转化模型**：
- 建立犬源稳定转染细胞系（HCT-116-TIM3），实现抗体功能快速验证
- 通过ExpiCHO系统实现抗体高效表达（IgG-29产量达8.2 mg/L）

### 四、应用前景与挑战
1. **治疗潜力**：
- 犬类肿瘤模型显示，IgG-29可使犬B细胞淋巴瘤（TCPN）细胞凋亡率提升42%
- 与PD-1抗体联用，对TIM3-GAL9共抑制通路阻断率达78%

2. **转化障碍**：
- 人源交叉反应率仅15%（IgG-29对HLA-A2阳性细胞系）
- 静脉注射制剂稳定性研究显示，抗体在pH 7.4条件下半衰期仅3.2小时

3. **技术优化方向**：
- 开发双功能抗体（如scFv-11与PD-1双靶向结构域）
- 构建犬源抗体库与人类抗体库的交叉验证平台

### 五、方法论贡献
1. **生物泛素化优化**：
- 建立"抗原轮换-缓冲液优化"方案，使抗体筛选效率提升至传统方法的3.5倍
- 开发基于barcoding的NGS分析系统，检测限达0.001%丰度克隆

2. **功能验证体系**：
- 创建"DTT敏感性-pepscan定位-流式验证"三级验证流程
- 建立犬源细胞转染模型（稳定表达率>90%）

3. **抗体工程创新**：
- 设计双CMV启动子表达系统，实现IgG-29产量提升至5.8 mg/L
- 开发抗体-抗原结合热力学分析模型（结合能计算误差<15%）

该研究为犬类肿瘤免疫治疗提供了关键工具，其方法体系（特别是NGS-NGS双验证）可推广至其他膜蛋白抗体的开发。未来需进一步解决抗体人源化改造和长效制剂开发难题，为建立跨物种免疫治疗平台奠定基础。