《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Sequence-dependent RNA cleavage by the 8–17 DNAzyme: Identification of preferred tetranucleotide motifs
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8-17 DNA酶在四核苷酸偏好性及RNA切割机制研究中，发现UGGG、UGGU、UGGA序列 cleavage效率显著提升，分子模拟揭示rG12·dA24非典型碱基对稳定形成是关键，为靶向FXI mRNA的基因治疗优化提供理论依据。
中岛里子（Satoko Nakajima）| 宫川修平（Shuhei Miyakawa）| 大野修（Shu Ohno）| 池本春树（Haruki Ikemoto）| 丸山利人（Rikuto Maruyama）| 千叶康辅（Kosuke Chiba）| 杉中亮太（Ryota Suginaka）| 大田千寻（Chihiro Oda）| 笠原雄也（Yuuya Kasahara）| 福泽香织（Kaori Fukuzawa）| 大塚智（Satoshi Obika）| 山口高夫（Takao Yamaguchi）
大阪大学药学研究科，日本大阪府吹田市山田冈1-6，邮编565-0871
摘要
近年来，能够催化RNA切割的脱氧核酶（DNA酶）因其潜在的治疗应用而受到越来越多的关注。其中，8–17 DNA酶是研究最广泛的DNA酶之一，这得益于其紧凑的催化核心和强大的催化活性。虽然已知8–17 DNA酶优先切割底物RNA链中的GG和AG（5′ → 3′）二核苷酸连接处，但侧翼核苷酸对催化效率的影响尚未得到系统研究。在这里，我们全面评估了8–17 DNA酶对四核苷酸序列的偏好。通过分析不同四核苷酸序列背景下可切割磷酸二酯键位于第二和第三个核苷酸之间的切割效率，我们发现了三种被显著增强切割效率的序列基序——UGGG、UGGU和UGGA。分子动力学和量子化学计算表明，UGGG基序中非典型的rG12·dA24碱基对的形成有助于形成具有切割能力的结构，而在切割效率较低的GGGG基序中，这种碱基对相对不稳定。这一序列偏好通过使用8–17 DNA酶针对小鼠凝血因子XI（FXI）mRNA的实验得到了进一步验证。总体而言，这些发现揭示了8–17 DNA酶的实际序列偏好，并为设计高活性DNA酶疗法提供了合理的框架。
引言
脱氧核酶（DNA酶）是通过体外筛选鉴定出的单链DNA，具有催化活性。1其中，能够切割RNA的DNA酶作为基因沉默剂特别具有吸引力。2,3它们通过侧翼结合臂与特定的RNA目标杂交，并通过定义明确的催化核心（图1A）催化特定位置的磷酸二酯键断裂。与反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA）不同，后者依赖于RNase H1或RNA诱导的沉默复合体（RISC）等内源性酶，DNA酶可以在单价或二价金属离子的存在下直接切割RNA。这种不依赖酶的机制，加上可编程的杂交臂，使DNA酶成为一种独特且多用途的寡核苷酸治疗平台。
迄今为止报道的能够切割RNA的DNA酶中，8–17和10–23基序（均由Santoro和Joyce于1997年发现）是研究最广泛的。4这两种DNA酶都具有独特的催化核心序列，每个序列由大约15个核苷酸组成，并由底物结合臂包围。8–17 DNA酶在GG二核苷酸连接处（5′ → 3′）表现出最大活性，5而AG是第二优选的切割位点；10–23 DNA酶则更倾向于切割嘌呤-嘧啶连接处（例如GU或AU）。42017年发表的8–17 DNA酶的X射线晶体结构分析显示，位于可切割磷酸二酯键附近的特征性非典型碱基对rG12·dA24和rG13·dT11（图1B和C）。6这些碱基对被认为在将可切割键定位到催化核心的沟槽中起着关键作用，从而实现高效切割。对于10–23 DNA酶，虽然尚未报道其活性形式的X射线晶体结构，但核磁共振光谱（NMR）和分子动力学（MD）模拟提供了其催化活性构象的见解。7,8有趣的是，最近对10–23基序的研究表明，切割效率不仅取决于可切割键处的二核苷酸序列，还取决于两侧的侧翼核苷酸，这些核苷酸共同构成了一个四核苷酸序列环境。9识别出优选的四核苷酸基序有助于开发适用于治疗应用的高活性DNA酶。
我们团队专注于优化8–17 DNA酶以靶向内源性RNA。通过策略性的化学修饰来提高核酸酶稳定性并调节目标亲和力，我们最近证明了一种化学修饰后的8–17 DNA酶能够在培养细胞中有效诱导RNA敲低。10在本研究中，我们系统评估了8–17 DNA酶对四核苷酸序列的偏好。通过对不同序列背景下的切割效率进行比较（其中可切割磷酸二酯键位于第二和第三个核苷酸之间），我们发现了三种被8–17 DNA酶优先切割的序列基序（UGGG、UGGU和UGGA）。值得注意的是，UGGG基序的切割效率最高，而GGGG基序的活性明显较低。计算分析表明，UGGG基序中的非典型rG12·dA24碱基对能够稳定维持，从而形成具有切割能力的结构。这一结构特征可能是该序列催化效率增强的原因。使用针对小鼠凝血因子XI（FXI）mRNA的8–17 DNA酶进一步验证了这一序列偏好。总体而言，这些发现揭示了8–17 DNA酶的序列偏好，并为设计高效DNA酶疗法提供了理论依据。
小节片段
寡核苷酸和试剂
本研究中使用的DNA和RNA寡核苷酸序列列于表S1、表S2、表S3和表S4中。所有寡核苷酸均由GeneDesign公司（日本大阪）合成和纯化。6-FAM标记的RNA使用5′-荧光素CE-磷酸酰胺（LGC Biosearch Technologies公司，英国霍德斯登）制备。化学试剂购自商业供应商，无需进一步纯化即可使用。8–17 DNA酶在切割位点的二核苷酸选择性
首先评估了DNA酶在RNA切割中的二核苷酸序列特异性。Kenny等人之前使用一种嵌合底物研究了8–17 DNA酶的二核苷酸偏好，该底物中只有切割位点的5′端核苷酸是RNA，而其余部分是DNA。5在那个研究中，当二核苷酸的5′和3′端核苷酸均为G时观察到最大活性，而其他核苷酸则导致活性显著降低。
结论
在这项研究中，我们系统地分析了8–17 DNA酶对四核苷酸序列的偏好，从而扩展了其先前已知的切割位点二核苷酸选择性。通过全面的切割实验，我们发现了三种切割效率显著增强的序列基序——UGGG、UGGU和UGGA。计算分析表明，UGGG基序中非典型的rG12·dA24碱基对的稳定形成与其切割能力相关
CRediT作者贡献声明
中岛里子：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，实验设计。宫川修平：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，方法学，实验设计。大野修：方法学，实验设计。池本春树：方法学，实验设计。丸山利人：方法学，实验设计。千叶康辅：方法学，实验设计，概念构思。杉中亮太：方法学，实验设计。大田千寻：方法学，实验设计。笠原雄也：方法学。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作部分得到了日本学术振兴会（JSPS）KAKENHI（资助编号：20K05748）、日本医疗研究开发机构（AMED）（资助编号：JP21ae0121022、JP21ae0121023和JP21ae0121024）、开放与跨学科研究计划研究所（OTRI）（第五波计划）、Hoansha基金会以及OU总体规划实施项目的支持。分子模拟和计算是在超级计算机上进行的。
