《Biosensors and Bioelectronics》：Programmable CRISPR-Mediated Gold Nanoparticle Adhesion for Visual Colorimetric Detection
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CRISPR-Cas12a介导的Cy5标记金纳米颗粒表面吸附机制实现HPV DNA高灵敏度检测，无需复杂仪器，适用于资源有限地区的点诊。
Kurt T. Schalper|Rui Yang|Xin Guan|Jiongyu Zhang|Daniel Schreiber|Jeong Moon|Changchun Liu
美国康涅狄格州法明顿市康涅狄格大学健康中心生物医学工程系，邮编06032
摘要
尽管金纳米粒子（AuNPs）的聚集行为在生物传感、催化和纳米医学领域已经得到了广泛研究，但通过可调表面化学实现可编程表面粘附的潜力仍大多未被开发。本文介绍了一种利用链霉亲和素包覆的AuNPs与Cy5-ssDNA-生物素探针结合的可编程CRISPR介导的疏水性粘附现象。AuNP表面的疏水性Cy5基团可诱导局部聚集并牢固粘附在疏水性表面上。这一独特性质被用于将CRISPR-Cas12a介导的ssDNA切割与Cy5标记的ssDNA包覆AuNPs结合，开发出一种简单、可视化读数的比色检测方法用于核酸检测。该方法结合重组酶聚合酶扩增后，能够实现对人类乳头瘤病毒（HPV）DNA的超灵敏检测，检测限低至10 aM，且无需复杂仪器。通过宫颈拭子样本的检测验证了该平台的临床应用潜力，显示出其在资源有限环境下的低成本、高灵敏度及便捷性。
引言
CRISPR/Cas（规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关）系统因其极高的特异性和可编程性而成为核酸检测的革命性工具。在各种Cas酶中，Cas12a因其强大的DNA靶向能力而受到广泛关注。（Barnes等人，2020年；Chen等人，2018年；Li等人，2018年）Cas12a与引导RNA形成核蛋白复合物，并识别互补的双链DNA。在目标识别后，Cas12a的辅助DNase活性被激活，导致附近单链DNA（ssDNA）的无差别切割。这种辅助切割活性已被广泛应用于使用荧光标记ssDNA探针的生物传感平台中，以实现高灵敏度的核酸检测。（Li等人，2023年；Myhrvold等人，2018年）然而，基于荧光的CRISPR诊断方法通常依赖笨重且昂贵的仪器，限制了其在资源有限环境中的应用。（Feng等人，2023年；Kellner等人，2019年）
最近，研究人员探索了基于CRISPR的比色方法，这些方法简化了工作流程和结果解读。（Fernandes等人，2020年；Ki等人，2022年；Pardee等人，2016年；Sun等人，2025年；Yang等人，2025b年）特别是那些利用金纳米粒子（AuNPs）实现无需复杂仪器即可进行肉眼检测的方法。（Cao等人，2021年；Hu等人，2020年；López-Valls等人，2022年）AuNPs因其独特的、与距离相关的光学特性而在传感和生物传感中得到广泛应用。（Saha等人，2012年；Sperling等人，2008年）例如，AuNPs已被用于将Cas酶活性转化为可见信号，用于基于CRISPR的分子诊断。（Fu和Xianyu，2023年）这些基于AuNPs的比色检测方法通常分为两类：基于聚集的（Cao等人，2021年；Li等人，2019年；Ma等人，2021年；Yuan等人，2020年）和非基于聚集的（Hu等人，2020年；López-Valls等人，2022年）。基于聚集的方法依赖于AuNP聚集或分散时颜色从红色变为紫色的变化。这些检测方法通常使用连接子ssDNA序列来聚集功能化纳米粒子，使上清液变为紫色。CRISPR酶切割这些ssDNA连接子会破坏聚集，恢复红色。（Cao等人，2021年；Li等人，2019年；Ma等人，2021年；Yuan等人，2020年）尽管这些方法有用，但它们存在高背景信号、低目标浓度时视觉对比度低以及复杂的预功能化步骤（包括冻融循环和盐老化）等挑战。这些多小时的过程需要-20°C至-80°C的储存条件，并且操作繁琐，限制了其在即时检测中的应用。（Cao等人，2021年）为了克服这些限制，研究人员探索了非聚集策略，如磁分离和探针诱导的纳米粒子失稳。（Hu等人，2020年；López-Valls等人，2022年）这些方法具有简化工作流程、加快检测时间和减少预功能化需求的优点，但也存在依赖外部磁铁或在阴性对照中产生较高背景信号等缺点，可能影响分析性能。（Hu等人，2020年；López-Valls等人，2022年）
在这里，我们展示了密集装载疏水性Cy5标记探针的AuNPs的可编程CRISPR介导的疏水性粘附现象，并描述了一种基于粘附的比色方法用于核酸检测，该方法快速、无需预功能化、设备简单且结果可视化。与传统基于聚集-分散的方法不同，我们的方法利用CRISPR介导的纳米粒子对疏水性表面的粘附作为信号转导机制。我们发现，链霉亲和素包覆的AuNPs（Strep-AuNPs）会密集积累疏水性Cy5-生物素探针，形成局部染料聚集体，生成纳米级簇或“粘附区”。（Kang等人，2010年；v. Berlepsch和B?ttcher，2015年）这些疏水性簇使纳米粒子牢固粘附在疏水性塑料管壁上，从而使上清液保持透明。利用这一独特性质，我们将CRISPR-Cas12a介导的探针切割与Cy5标记的ssDNA包覆AuNPs结合，开发出一种简单的、可视化的比色检测方法用于人类乳头瘤病毒16型（HPV 16）DNA检测。我们进一步通过宫颈拭子样本结合重组酶聚合酶扩增（RPA）验证了其临床可行性。
材料与试剂
除非另有说明，所有化学品和试剂均按原样使用。OD10链霉亲和素包覆的40 nm BioReady金纳米球购自Sigma-Aldrich（NanoComposix系列）。所有实验均使用无核酸酶的水（New England Biolabs）。Lba Cas12a（Cpf1）和NEBuffer 2.1购自New England Biolabs。50个核苷酸生物素标记的单链DNA（ssDNA）探针（带有Cy5或FAM修饰）由Integrated DNA合成并购买。
可编程疏水性粘附实现CRISPR转导机制
图1展示了我们CRISPR介导的疏水性粘附检测的工作原理。与传统的基于AuNPs的比色检测方法不同（该方法依赖于将两种不同的AuNP群体聚集在一起，见图S1），我们利用了Cy5标记的ssDNA包覆AuNPs的疏水性粘附行为。该系统基于纳米粒子对疏水性管壁的可编程粘附来产生信号转导，而不是基于纳米粒子聚集。
结论
在这项研究中，我们提出了一种新的基于CRISPR的比色检测信号转导机制，该方法利用可编程的纳米粒子-表面粘附而非传统的聚集。我们证明了未切割的Cy5标记ssDNA-生物素探针与链霉亲和素包覆的AuNPs结合后，能够实现对疏水性管壁的强而可逆的粘附，这与我们假设的纳米级疏水性簇机制一致。我们的发现建立了一种基于粘附的信号转导机制。
CRediT作者贡献声明
Kurt T. Schalper：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、形式分析、概念化。Rui Yang：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、研究、形式分析。Xin Guan：撰写 – 审稿与编辑、验证、研究、形式分析。Jiongyu Zhang：撰写 – 审稿与编辑、方法学、研究。Daniel Schreiber：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、研究。
未引用的参考文献
v Berlepsch和B?ttcher，2015年。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）的U01CA269147资助和康涅狄格大学研究卓越计划（REP）的奖励。
