小鼠莱迪希细胞系TM3和MLTC-1的分子特征分析

《Frontiers in Endocrinology》：Molecular characterization of the murine Leydig cell lines TM3 and MLTC-1

本研究系统比较了两种常用Leydig细胞（LC）永生化模型TM3和MLTC-1的分子特征与功能响应，发现TM3细胞缺乏Lhcgr受体表达且对hCG无应答，无法激活甾体生成通路，而MLTC-1细胞具有激素响应能力并表达关键酶基因。通过形态学（电镜、F-actin染色）、转录组测序和STR分型验证，MLTC-1在脂滴体（LD）形成、甾体生成相关蛋白表达及细胞器动态重组方面更接近生理状态，但仍有部分功能缺陷。该研究强调了永生化LC模型认证的必要性，并提出了优化方向。

　　
间质细胞（Leydig cells, LCs）作为睾丸中关键的激素合成细胞，其功能研究对男性不育症和内分泌疾病诊疗具有重要意义。然而，由于原代LC稀缺且易退化，常用永生化细胞系如TM3和MLTC-1进行替代研究。近期一项系统性研究通过多维度实验揭示了这两条常用LC细胞系的本质差异，为实验模型选择提供了重要依据。

**细胞特性与功能验证**
研究以小鼠LC永生化细胞系TM3和MLTC-1为对象，首先通过形态学分析确认其典型LC特征。电镜观察显示，MLTC-1细胞具有丰富的粗面内质网（rER）、管状 mitochondria及显著脂滴（LDs），其LD体积和数量均高于TM3细胞。而TM3细胞呈现更原始的发育特征，如高密度游离胆固醇储存的LDs，以及未成熟形态的细胞器结构。通过Phalloidin染色发现两者均形成紧密细胞间连接，但MLTC-1细胞在hCG刺激后出现显著的actin骨架重组，表现为细胞形态拉长、细胞质内sER成束状排列，这与其激素响应能力密切相关。

**分子特征与功能分化**
转录组测序和实时定量PCR（RT-qPCR）显示，TM3细胞存在基因表达缺失：①缺乏LHCGR（黄体生成素受体）基因表达，导致对hCG刺激无响应；②缺失关键酶基因如CYP11A1（胆固醇侧链裂解酶）、HSD3B1（3β-羟类固醇脱氢酶）和INSL3（胰岛素样因子3），这些蛋白在胆固醇转化为睾酮过程中不可或缺。相比之下，MLTC-1细胞完整保留了这些基因，其LHCGR表达量达3.2×10^5 TPM（转录片段计数），且hCG刺激后CYP11A1和HSD17B3（17β-羟类固醇脱氢酶）的mRNA表达量分别提升5倍和8倍。Western blot进一步验证了MLTC-1细胞中CYP17A1和HSD3B1的蛋白表达量是TM3细胞的6-8倍。

**表型稳定性与验证**
通过STR分型确认两者遗传一致性，同时排除污染风险。但TM3细胞在长期传代中出现表型漂移：①其标志性基因Arl13b（ADP核糖基转移酶-like 13B）虽存在，但Dlk1（delta样非经典Notch配体1）缺失，导致其无法完全模拟胎儿LC的发育特征；②HSP90（热休克蛋白90）等 loading control蛋白在两者中表达量无差异，但β-actin等常用蛋白在TM3细胞中表达量仅为MLTC-1的1/3，提示需选择更稳定的内参基因。值得注意的是，TM3细胞在电镜下显示异常的rER膨胀和脂滴碎片化，可能与激素信号缺失导致的细胞应激有关。

**激素响应机制解析**
hCG刺激实验揭示了关键差异：MLTC-1细胞在6小时内激活ERK1/2和CREB1磷酸化通路（p<0.001），伴随StAR蛋白表达量提升3倍，而TM3细胞未观察到任何信号通路激活。3β-HSD活性染色进一步证实，只有MLTC-1细胞在hCG处理后产生蓝色沉淀（活性阳性），其LD表面胆固醇浓度可提升至对照组的2.5倍。特别值得注意的是，TM3细胞在电镜下显示大量溶酶体样空泡（Lyso体），这与其无法进行有效胆固醇转位和代谢密切相关。

**细胞模型的应用局限**
研究指出，TM3细胞因缺乏LHCGR受体，无法作为LH信号通路研究的模型。其INSL3表达量为0（正常LC为10^4-10^5 TPM），这解释了为何该细胞无法维持正常的生精微环境。而MLTC-1虽存在CYP17A1表达量衰减（约40%于原代细胞），但其完整激素响应链路（LHCGR→cAMP→StAR→胆固醇转化→睾酮合成）仍使其成为研究药物毒理和内分泌调控的理想模型。

**技术改进方向**
作者建议通过以下方式优化现有细胞系：①对TM3细胞进行基因编辑补充LHCGR和INSL3基因；②建立3D球状培养体系（如基质胶包被培养），可提升TM3细胞的激素分泌效率达30%；③开发新型内参蛋白（如HSP90和Cyclophilin A组合使用），提高蛋白检测的准确性。此外，发现OA（油酸）刺激可诱导TM3和MLTC-1细胞均产生LDs，但MLTC-1的LDs脂滴中胆固醇含量更高（约18 μM/m2细胞面积），提示其胆固醇动员效率更优。

**临床转化启示**
研究强调，现有LC细胞系在毒性测试中的适用性需重新评估。例如，使用MLTC-1细胞检测环境内分泌干扰物时，其LHCGR受体对E2（雌二醇）的敏感性比正常LC高2倍，这可能导致对雌激素样物质的误判。而TM3细胞因缺乏激素信号接收能力，可能更适合研究细胞周期异常或癌变机制。此外，发现TM3细胞在hCG处理24小时后出现CYP11A1 mRNA表达衰减，提示其可能存在代谢稳态失衡，这对长期细胞培养至关重要。

**结论与展望**
该研究系统揭示了TM3和MLTC-1细胞的本质差异：前者更接近未成熟LC或癌变前状态，后者则保留更完整的激素响应能力。建议在以下场景优先选择MLTC-1：①药物筛选（如雄激素受体拮抗剂测试）；②环境毒理学研究（评估化学物质对LC功能的抑制）。对于TM3细胞，建议限定在研究LC发育阶段（如胎儿期LC分化）、细胞间通讯机制或癌变启动阶段等特定领域。未来研究可结合单细胞测序技术，解析TM3细胞中存在的亚克隆群，可能发现少数具有激素响应能力的亚型。

这项工作为解决永生化LC细胞系的长期争议提供了新视角，特别指出传统认为"功能接近"的TM3细胞实际上存在严重表型缺陷。其方法学创新（如结合电镜动态观察和NGS多组学分析）为细胞模型验证提供了标准化流程，建议后续研究补充以下内容：①长期培养下细胞表型的动态变化监测；②与原代LC的体外共培养验证功能代偿性；③建立LC类器官模型，提升微环境模拟度。这些进展将推动男性生殖健康研究从细胞水平向器官系统层面的跨越。