综述：超越DNA序列：绘制动态表观遗传图谱用于急性髓系白血病的风险分层和治疗干预

《Clinical and Experimental Medicine》：Beyond the DNA sequence: mapping the dynamic epigenetic landscape for risk stratification and therapeutic intervention in acute myeloid leukemia

这篇综述系统阐述了急性髓系白血病（AML）中超越DNA序列的动态表观遗传调控机制，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质三维结构及非编码RNA（ncRNA）等层面的最新研究进展。文章重点探讨了如何利用单细胞多组学技术解析肿瘤异质性，并详细分析了表观遗传生物标志物在风险分层、微小残留病（MRD）监测及预测新型表观遗传疗法（如menin抑制剂、LSD1抑制剂）反应方面的巨大转化潜力，为AML的精准医学时代提供了新视角。

　　

引言：AML中的表观遗传必要性

急性髓系白血病（AML）是一种遗传异质性血液恶性肿瘤，其特征是未成熟髓系原始细胞克隆性扩增，伴随分化阻滞和异常的自我更新能力。传统的基于细胞遗传学异常和复发性基因突变的分类系统（如欧洲白血病网ELN风险分层）在预测预后和指导治疗决策方面虽发挥重要作用，但其局限性日益显现，因为即使在已确定的遗传亚组内，仍存在显著的结局异质性。这表明，除了DNA序列变异之外的因素，对AML的发病机制和临床行为起着关键作用。

表观基因组涵盖了不改变底层DNA序列的可遗传基因表达变化，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA（ncRNA）的调控。在正常造血过程中，表观遗传机制精细调控造血干细胞（HSC）的自我更新与分化之间的平衡。如今，表观遗传失调被认为是白血病发生的一个基本驱动因素，超过50%的AML病例存在编码表观遗传调节因子（如DNMT3A、TET2、IDH1/2、ASXL1、EZH2）的基因体细胞突变。这些突变扰乱了正常的表观遗传模式，导致异常的DNA甲基化景观、扭曲的组蛋白修饰特征，并最终引发促进自我更新同时损害分化的扭曲转录程序。

AML中的表观遗传失调范围超越了突变事件，涵盖了更广泛的、不一定与基因突变相关的表观遗传改变。AML细胞表现出普遍的表观遗传异常，包括全基因组DNA低甲基化与位点特异性CpG岛高甲基化并存、异常的组蛋白修饰模式以及被破坏的染色质结构。此外，非编码RNA，特别是长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA），已成为AML表观遗传景观的重要贡献者。

基础层面：DNA甲基化生物标志物

AML的特征是深刻的表观遗传失调，其中DNA甲基化改变是理解疾病发病机制、分类和风险分层的基石。对编码表观遗传修饰因子（如DNMT3A、TET2、IDH1/2）基因中复发性突变的识别，为这些甲基化异常的机制基础提供了关键见解。这些突变主动塑造了甲基化组，通过沉默肿瘤抑制基因、破坏分化通路以及赋予造血祖细胞自我更新能力，促进白血病表型的形成。

全基因组分析表明，DNA甲基化组的集体扰动是AML的一个决定性特征。这些改变在基因组中并非均匀分布，而是高度富集于特定的调控区域，特别是增强子和CpG岸区，它们比传统的启动子相关CpG岛表现出更显著的差异甲基化。AML原始细胞可同时表现出全基因组低甲基化（导致基因组不稳定性）和特定基因位点的局部高甲基化（导致对造血分化和肿瘤抑制至关重要的基因沉默）。

对AML甲基化组破坏的全面理解推动了DNA甲基化分类器的发展，这些分类器超越了传统的遗传分类。全基因组甲基化数据的无监督聚类一致地识别出三种主要的CpG岛甲基化表型（CIMP）：CIMP-high（CIMP-H）、CIMP-medium（CIMP-M）和CIMP-low（CIMP-L），它们表现出不同的临床结局、突变景观和免疫微环境。例如，常携带DNMT3A突变的CIMP-L亚型预后最好，而CIMP-H亚型则与最差的总生存期相关。

尽管DNA甲基化生物标志物前景广阔，但其成功转化为常规临床实践仍需克服若干挑战。主要障碍包括患者样本中的细胞异质性、表观基因组在治疗选择压力下的动态演变，以及从发现平台转向稳健、经济高效且临床可操作的靶向检测技术。机器学习（ML）和人工智能（AI）的应用有望通过整合大型多维甲基化组数据集来构建预测模型，但需要大型、注释良好的患者队列进行训练和验证。最终，在任何甲基化生物标志物或分类器被整合到标准诊断和治疗算法之前，必须在独立的、多机构队列中进行前瞻性验证，以确定其临床效用和可靠性。

扩展视野：新兴表观遗传层面

除了DNA甲基化和组蛋白修饰，近期研究揭示了越来越复杂的表观遗传控制层，包括RNA修饰、三维染色质结构和组蛋白变体，它们共同构成了一个动态调控网络。

表观转录组：RNA修饰作为生物标志物

表观转录组涉及RNA分子的转录后修饰，显著影响其功能、稳定性和翻译效率。在AML中，N6-甲基腺苷（m⁶A）是研究最深入的RNA修饰。METTL3（写入器）在AML中经常过表达，通过m⁶A依赖性机制增强关键致癌驱动因子（如MYB、MYC、BCL2）的翻译。其催化活性增强与不良临床结局和化疗耐药相关。此外，5-甲基胞嘧啶（m⁵C）和假尿苷（Ψ）等修饰也被认为是AML发病机制的重要贡献者。靶向RNA修饰酶（如FTO、METTL3）显示出治疗潜力。

染色质结构与3D基因组学

染色质在细胞核内的三维组织是基因表达控制的基本调控层。拓扑关联域（TAD）是其中的核心，它们是自我相互作用的基因组区域。在AML中，与正常造血干祖细胞（HSPP）相比，恶性细胞表现出广泛的TAD边界改变，这些结构重排常导致异位增强子-启动子相互作用，从而激活癌基因或沉默抑癌基因。更高阶的染色质结构，如核纤层关联域（LAD）和染色质环，也被证实是AML发病机制的重要参与者。染色质构象分析可将患者分为不同的预后组，并识别由结构变异引起的增强子/沉默子劫持事件，为靶向染色质结构 machinery（如CTCF/黏连蛋白）或使用去甲基化药物（HMA）恢复正常组织提供了新的治疗机会。

组蛋白变体与癌组蛋白

组蛋白本身的突变，即“癌组蛋白”，可通过深刻改变表观遗传景观驱动白血病发生。在AML中，已在几个H3变体的关键残基（如Q69H、A26P、R2Q、R8H以及熟知的K27M）鉴定出复发性突变。这些突变是白血病发生的早期事件。例如，H3K27M突变通过抑制多梳抑制复合体2（PRC2）的催化活性，导致H3K27me3全局减少和H3K27ac局部增加，从而异常激活促进自我更新和阻断分化的基因表达程序。癌组蛋白的识别对风险分层和治疗开发具有重要意义，它们创造了独特的表观遗传脆弱性，可作为治疗靶点。

功能性调节因子：非编码RNA占据主导地位

非编码RNA网络深刻塑造了AML的表观遗传景观，已成为白血病发生、疾病进展和治疗反应的关键调节因子。特定的microRNA（miRNA）和lncRNA通过调节关键信号通路，作为真正的癌基因或抑癌基因发挥作用。例如，miR-155在AML中经常过表达，通过直接抑制SHIP1和CEBPB来驱动髓系增殖。相反，let-7家族作为肿瘤抑制因子，其被LIN28B（常在AML中上调）抑制可促进自我更新并阻断髓系分化。在lncRNA中，HOTAIRM1通过与染色质修饰因子相互作用微调HOXA基因表达。新发现的LINC01629（LNC-ECAL1）在AML干细胞中上调，并通过与DNMT1和EZH2形成RNA-蛋白质复合物来促进白血病发生。

特定非编码RNA在循环生物流体中的显著稳定性为AML管理中的无创液体活检开辟了新途径。研究表明，血浆miR-92a和miR-99a水平与骨髓原始细胞百分比显著相关，可用于无创疾病监测和早期复发检测。外泌体lncRNA（如HOTAIR、PVT1）在AML患者血清中富集，并在不同遗传亚型间呈现差异表达，提供独立于常规风险因素的预后信息。

除了熟知的miRNA和lncRNA，前沿研究还发现了tRNA衍生片段（tRF）和circRNA这两类全新的表观遗传调节因子。tRF（如tRF-3001a、tRF-3003a）可以像miRNA一样沉默靶基因，影响AML原始细胞的凋亡和分化。值得注意的是，源自特定tRNA 5'端的tRF（tRF-5s）特征可以高精度预测骨髓增生异常综合征（MDS）向AML的转化。circRNA则以其共价闭合环状结构为特征，表现出非凡的抗核酸外切酶能力，并在AML细胞中高水平积累。例如，circ-VIM通过吸附miR-20a-5p来促进细胞周期进程并抑制凋亡。某些circRNA甚至被发现可编码具有调控功能的新型肽。

这些非编码RNA的转化潜力巨大，但临床实施前仍需解决标准化、动态变化和细胞异质性等挑战。计算工具和大型前瞻性队列验证对于将其整合到AML的风险分层和治疗选择中至关重要。

单细胞多组学：解析表观遗传异质性

单细胞多组学技术的出现通过实现对单个细胞内基因组、转录组和表观基因组特征的同时探查，彻底改变了我们对AML表观遗传学的理解。这些方法揭示了白血病群体内部前所未有的异质性程度，发现了驱动治疗耐药和复发的调控回路。

单细胞表观基因组学的技术革命包括scATAC-seq（单细胞转座酶可及染色质测序）、scChIC-seq（单细胞染色质免疫切割测序）和CITE-seq（转录组和表位细胞索引测序）等方法。这些技术揭示了看似同质的AML群体内染色质状态和转录程序的显著异质性。例如，在t(8;21) AML中整合scRNA-seq和scATAC-seq分析，确定了TCF12是AML1-ETO包含的转录因子复合物（AETFC）的核心组分。对治疗耐药AML样本的多组学分析揭示了异质的谱系组成，挑战了关于AML分化阻滞的传统观点。

将这些技术应用于白血病干细胞（LSC）揭示了其表观遗传可塑性和调控复杂性。scATAC-seq分析表明，LSC表现出独特的染色质可及性模式，其特征是富集干性相关转录因子基序和抑制分化通路。这些LSC特异性表观遗传特征在治疗后持续存在，并与不良临床结局相关。单细胞多组学还使得能够识别新的LSC特异性调控回路。此外，结合线粒体DNA测序与scATAC-seq（mtscATAC）的研究表明，不同的线粒体定义克隆可在复发时经历趋同的表观遗传进化，这凸显了非遗传机制在治疗失败中的重要性。

单细胞多组学数据与机器学习方法的整合进一步增强了我们预测临床结局和识别新治疗脆弱性的能力。例如，基于机器学习的scRNA-seq和scATAC-seq数据整合生成了稳健的9基因预后特征。计算分析还识别出在LSC中特异性激活并与耐药相关的增强子元件。

尽管取得了这些进展，但在将单细胞多组学技术应用于临床方面仍存在技术、计算和验证方面的挑战。然而，这些方法已经为AML的表观遗传异质性提供了前所未有的见解，为风险分层和治疗干预提供了新途径。

将表观遗传生物标志物转化至临床

将表观遗传生物标志物整合到临床决策中代表了AML管理的范式转变。表观遗传标记提供了关于疾病生物学、预后和治疗脆弱性的补充信息。

完善风险分层：整合表观遗传分类器与遗传数据

整合表观遗传-遗传分类器系统的开发代表了AML风险分层的重大进展。DNA甲基化分析已识别出超越传统遗传分类的独特表观遗传亚型。例如，一项重要研究表明，一个七基因甲基化评分（CD34、RHOC、SCRN1、F2RL1、FAM92A1、MIR155HG、VWA8）能独立于基因突变显著预测总生存期。这种表观遗传分类器在包含已确立遗传风险因素的多变量模型中保持预后显著性。在细胞遗传学正常（CN-AML）亚组中，DNA甲基化模式可以区分具有相似遗传特征但结局不同的患者。

表观遗传微小残留病（eMRD）：通过异常甲基化panel检测残留疾病

eMRD检测利用癌症特异性甲基化模式的稳定性，其灵敏度可达0.001%（10^-5），超过了许多当前MRD方法的灵敏度阈值。有效的eMRD检测需要仔细选择在正常造血细胞中背景甲基化最小、且在白血病中具有一致特异性模式的甲基化标记。临床验证研究显示eMRD状态与临床结局密切相关。未来的方向包括开发结合遗传、免疫表型和表观遗传标记的整合MRD评估，以及探索在液体活检中检测细胞游离DNA中的甲基化标记。

预测和监测表观遗传疗法反应

随着表观遗传疗法的出现，对预测性生物标志物的需求日益迫切。对于传统的去甲基化药物（HMA），如阿扎胞苷和地西他滨，反应预测仍然具有挑战性。DNA甲基化分析已识别出潜在的预测特征。对于针对特定分子通路的新型表观遗传疗法，生物标志物驱动的患者选择至关重要。Menin抑制剂在具有KMT2A重排或NPM1突变的AML中显示出显著活性，反应与HOXA/MEIS1表达的降低相关。LSD1抑制剂的预测性生物标志物包括LSD1本身的表达水平。对于BET抑制剂，虽然预测性生物标志物不太明确，但高BRD4表达和特定遗传背景可能富集反应人群。

挑战与未来展望

将表观遗传分析整合到AML的临床决策中面临若干重大挑战。表观基因组的动态性质提供了前所未有的机会，但这种复杂性也给从当前技术产生的海量多维数据中破译临床可操作模式带来了巨大障碍。

技术与分析挑战

当前的表观遗传分析技术在灵敏度、可重复性和可扩展性方面存在局限性。单细胞多组学方法在技术上要求高且成本昂贵。多维表观遗传数据的分析和整合需要复杂的计算基础设施和高级生物信息学专业知识。需要标准化的协议和分析框架。未来的努力必须集中在开发简化、经济高效的表观遗传分析平台上。

生物学复杂性与异质性

AML肿瘤内显著的表观遗传异质性对开发统一的分类系统和靶向治疗构成了根本性挑战。瘤内表观遗传多样性使得白血病亚克隆能够功能特化，促进对治疗压力的适应并导致复发。骨髓微环境增加了另一层复杂性。未来的研究必须优先开展纵向研究，追踪从诊断到复发的表观遗传演变，并更加强调理解骨髓微环境内表观遗传状态的空间组织。

治疗开发障碍

目前的表观遗传疗法，包括HMA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂，作为单一疗法疗效有限，且常产生异质性反应。这些药物的非特异性性质导致广泛的表观遗传调节而非针对性纠正疾病特异性改变。耐药性的发展仍然是一个重要问题。未来的药物开发应侧重于具有改进特异性的下一代表观遗传疗法，以及同时靶向表观遗传机制和协同通路的联合策略。

临床转化挑战

表观遗传生物标志物向临床实践的转化面临显著的验证和标准化障碍。虽然许多研究提出了表观遗传分类系统和预后特征，但很少在大型前瞻性临床试验或不同患者群体中得到严格验证。将表观遗传风险评估整合到既定框架（如ELN指南）中需要证明其独立于当前遗传标记的预后价值和临床效用。此外，开发用于监测表观遗传演变和治疗反应的临床适用检测也面临技术和物流挑战。未来的努力应优先开展大规模协作研究，在前瞻性队列中验证表观遗传生物标志物，并开发可在临床实验室部署的标准化检测方法。

未来展望与方向

AML表观遗传研究的未来在于开发整合的多维方法，以捕捉表观遗传景观的复杂性及其功能后果。技术创新将提供对AML调控架构及其治疗脆弱性的前所未有的见解。将人工智能和机器学习方法应用于大规模表观遗传数据集对于识别预测模式和生成临床可操作的分类器至关重要。从治疗角度看，开发更特异性的表观遗传药物和合理的联合方案有望克服当前局限性并实现持久反应。在临床上，将表观遗传分析整合到在整个疾病过程中演变的动态风险评估模型中，可能实现真正个性化的治疗方法。

结论

“超越DNA序列”的探索揭示了一个复杂且动态的表观遗传景观，它对AML的发病机制和临床行为至关重要。这篇综述强调了仅凭基因突变无法提供完整的图像，而表观遗传改变（包括DNA甲基化模式、组蛋白修饰、3D染色质结构和调控性非编码RNA）为疾病异质性、预后和治疗脆弱性提供了更深入、更细致的理解。单细胞多组学的出现尤其具有变革性，它以前所未有的分辨率解析了这种复杂性，并识别出驱动复发的LSC内部 resilient 的表观遗传回路。将这些见解通过表观遗传风险分类器、灵敏的eMRD监测以及靶向疗法的生物标志物转化到临床，代表了AML管理的下一个前沿领域。尽管在标准化和临床整合方面存在挑战，但绘制表观遗传图谱的共同努力有望完善预后模型并解锁新颖的、个性化的治疗干预措施，使我们更接近改善这种棘手疾病患者生存率的目标。