冻存骨髓间充质干细胞直接复苏应用：保留成骨机制与推动骨再生临床转化的新策略

《Stem Cell Reviews and Reports》：Directly Thawed Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells Retain Mechanism of Action and Support Bone Clinical Translation

本刊推荐：为解决自体骨髓间充质干细胞（BMSCs）临床应用中的物流限制和手术时间匹配难题，研究人员开展冻存BMSCs（cryo-BMSCs）直接复苏移植的可行性研究。通过体外细胞活力动力学、基因表达谱分析及体内血管生成和骨形成实验，证实cryo-BMSCs在成骨分化、血管生成、炎症反应等关键功能方面与新鲜细胞（fresh-MSCs）等效。该研究为建立"即用型"细胞库、优化骨组织工程临床方案提供重要依据。

　　

在再生医学领域，骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stromal Cells, MSCs）因其多向分化能力和免疫调节特性，已成为治疗骨缺损、骨坏死等疾病的明星细胞。特别是在欧洲大型临床项目（如REBORNE、ORTHOUNION和MAXIBONE）中，自体MSCs与生物材料结合已成功应用于颌骨缺损和长骨不愈合的治疗。然而，传统的"新鲜细胞"方案要求细胞采集、扩增、运输和移植必须在严格的时间窗口内完成，任何环节的延误都可能导致整个治疗失败。这种缺乏灵活性的流程不仅造成医疗资源浪费，更使患者面临二次手术的风险。

如图1所示，现有方案（选项A）需要将患者髂骨采集的细胞立即送往细胞制备中心，扩增后再运回临床机构进行移植。这一过程面临三大挑战：不同患者间细胞增殖速率差异导致扩增时间个性化需求与固定手术日程的矛盾；细胞产品放行检验结果可能迟于移植时间点，引发安全性隐患；一旦计划中断，患者既无法回输自身细胞，还需承担已产生的细胞制备费用。

受造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）冻存移植成功经验的启发，研究团队提出将MSCs进行冻存，在手术时直接复苏使用的创新方案（选项B）。但关键问题在于：经过冻融循环的MSCs是否能保持其成骨活性和血管生成能力？既往研究多关注MSCs的短期分泌效应，而骨再生需要细胞长期存活并参与分化，这方面尚缺乏系统评估。

本研究通过系列实验首次全面评估了冻存MSCs（cryo-MSCs）在骨再生中的功能等效性。主要技术方法包括：采用流式细胞术（7AAD染色）分析细胞存活动力学；通过实时定量PCR（RT-qPCR）检测成骨（Runx2、BMP2、ALP、IBSP、OC、OPN）、血管生成（VEGF、PGF）、炎症（IL6、IL8）和增殖（Ki67）相关基因表达；利用Matrigel? plug模型评估体内血管生成能力；通过免疫荧光染色（Isolectin B4标记）和物种特异性基因表达分析量化新生血管；采用SCID小鼠皮下植入模型（MBCP+?支架负载细胞）评估骨形成能力，并结合组织学（Masson三色染色）和人类基因特异性检测分析新骨形成和细胞参与情况。

细胞存活动力学显示冻存细胞具临床适用性

研究发现，复苏即刻（T0）cryo-MSCs死亡率（24%）显著高于fresh-MSCs（5%）。但模拟临床运输条件（室温2-6小时）下，fresh-MSCs死亡率持续上升至17%-25%，而cryo-MSCs保持稳定，2小时后两组无显著差异。延长保存24小时显示，4°C条件下cryo-MSCs存活率与fresh-MSCs相当，证实其耐受性满足临床物流需求。

基因表达谱证实功能完整性

关键功能基因表达分析显示，cryo-MSCs在成骨分化（Runx2、BMP2）、血管生成（VEGF、PGF）、炎症因子（IL6、IL8）和增殖标记（Ki67）方面与fresh-MSCs无统计学差异，表明冻存过程未改变细胞的核心功能特性。

体内血管生成能力保持等效

Matrigel? plug实验表明，cryo-MSCs与fresh-MSCs均能有效招募宿主内皮细胞，形成红细胞灌注血管。免疫荧光定量（Isolectin B4⁺细胞）和小鼠内皮基因（mPECAM-1、mVE-CADH）表达均显著高于空白对照组，且组间无差异。同时，植入细胞持续表达人源血管生成因子（hVEGF、hPGF），证实其直接参与血管形成。

炎症反应无显著差异

小鼠炎症相关基因检测显示，两组均未引起中性粒细胞（Ly6G^-）浸润，巨噬细胞标记（F4/80、Ly6C、MRC1）表达模式相似，表明冻存细胞未加剧免疫排斥反应，为长期存活奠定基础。

骨形成能力与细胞参与度高度一致

细胞存活动力学显示，植入后6周内两组细胞存活率变化趋势相同（6小时：37% vs 25%；6周：9% vs 5%）。成骨基因表达在1-6周均呈现时间依赖性上调，且组间无差异。组织学定量分析证实，cryo-MSCs组新骨形成面积占比（26±4.5%）与fresh-MSCs组（25±4.4%）等效。更重要的是，检测到人源成骨基因表达，直接证明冻存细胞存活并参与骨基质合成。

结论与讨论部分强调，本研究首次通过体内外实验系统验证了cryo-MSCs在骨再生中的全功能等效性。其重要意义在于：突破性地解决了细胞治疗产品临床应用的灵活性瓶颈，使手术时间与细胞制备"脱钩"；通过建立"即用型"细胞库，可大幅降低治疗成本（单次采集可制备多剂量），并为异体细胞库建设提供理论依据。尽管DMSO（二甲基亚砜）洗脱步骤的优化仍需探索，但本研究为Advanced Therapy Medicinal Products（ATMP，先进治疗医学产品）的标准化和规模化应用扫除了关键技术障碍。

这项由Tiffany Marie等研究人员完成的工作，发表于《Stem Cell Reviews and Reports》，不仅为骨再生医学提供了新策略，更开创性地拓展了MSCs在临床中的应用模式。未来，随着冻存技术的进一步优化，这种"off-the-shelf"（即用型）治疗理念或可推广至其他组织工程领域，真正实现细胞治疗的普惠化应用。