基于加权核稀疏与全变分正则化的RGB图像巴氏染色分离技术及其在宫颈癌定量诊断中的应用

《Medical & Biological Engineering & Computing》：Papanicolaou stain unmixing for RGB image using weighted nucleus sparsity and total variation regularization

针对巴氏染色(Papanicolaou stain)中染料数量超过RGB通道导致的解混难题，本研究提出一种无需训练的优化算法，结合非负性约束、加权核稀疏性（针对苏木精H）和全变分平滑正则化，实现了四染料（EY/H/LG/OG）的精准定量分离。该方法在多光谱成像验证中表现出色（SRE达13.29 dB），并成功区分小叶性宫颈腺体增生（LEGH）与正常宫颈细胞（分类准确率98.0%），为宫颈癌筛查提供了客观的染色量化新工具。

　　

在宫颈癌的细胞学筛查中，巴氏染色（Papanicolaou stain）通过五种染料（苏木精H、伊红EY、亮绿LG、橙黄OG和俾斯麦棕BY）的组合，为细胞核和细胞质提供了丰富的颜色信息。然而，传统依赖肉眼观察颜色的方式存在主观性强、难以量化的问题。尽管数字图像分析技术试图解决这一难题，但RGB（红绿蓝）图像的强度易受染色条件和成像设备的影响，直接量化可靠性低。更关键的是，巴氏染色使用的染料数量（5种）多于RGB图像的通道数（3个），使得从RGB图像中精确分离各染料含量成为一个病态问题。此前研究多基于多光谱（MS）成像技术估算染料含量，但多光谱相机在临床病理成像中并不普及，且扫描过程耗时较长。因此，开发一种能够利用常规RGB全切片图像（WSI）进行巴氏染色定量解混的方法，具有重要的临床实用价值。

本研究由东京科学大学（Institute of Science Tokyo）的Nanxin Gong等人完成，论文发表于《Medical & Biological Engineering & Computing》。研究人员提出了一种新颖的、无需训练的巴氏染色解混方法，专门用于RGB图像。该方法将问题构建为一个凸优化问题，通过引入三种先验知识作为正则化项：染料含量的非负性、针对细胞核染料H的加权核稀疏性（促使H在细胞核区域富集而非细胞质）以及全变分（TV）正则化（保证相邻像素间染料含量的平滑过渡）。

为开展研究，团队制备了巴氏染色和单染样本，并利用多光谱显微镜相机（Vectra 3）采集14个波段（440-720 nm，间隔20 nm）的图像，进而合成为sRGB格式图像用于分析。关键的技术方法包括：通过单染样本预先测定染色矩阵（Stain Matrix）A；将RGB图像转换至光密度（OD）空间；采用基于交替方向乘子法（ADMM）的优化算法求解包含加权核稀疏和TV正则化的目标函数；最后利用多光谱染色解混结果作为金标准进行验证，并应用于区分正常宫颈内膜（EC）细胞和小叶性宫颈腺体增生（LEGH）细胞。

研究结果

1. 染色定量性能评估

研究以多光谱解混结果为金标准，采用信号重构误差（SRE）和均方根误差（RMSE）作为评价指标。与颜色解卷积（CD）、稀疏非负矩阵分解（SNMF）、SUnSAL-TV以及深度学习模型（ColorAE、U-Net）等方法相比，本研究提出的方法在测试图像块上取得了最优的整体性能（中位SRE为13.29 dB，中位RMSE为0.039）。

特别是，提出的加权核稀疏约束有效缓解了H在非核区域的过度估计，从而提高了所有四种染料（EY, H, LG, OG）的估计精度。而传统的稀疏约束（如SUnSAL-TV中的l1范数）由于假设染料在图像中是稀疏存在的，这不适用于巴氏染色图像（多种染料常共存于同一像素），因此效果不佳。深度学习模型中，U-Net凭借其跳跃连接保持空间结构信息，性能接近所提方法，但需要大量标注数据训练。

2. 参数敏感性与运行时间

参数敏感性分析表明，本研究方法的性能在较宽的参数范围内优于对比方法，且其最优参数在不同图像间一致性高，显示出良好的鲁棒性。运行时间方面，所提方法处理256x256像素块平均耗时9.96秒，虽慢于深度学习前向传播，但无需训练且可扩展至任意图像尺寸。

3. 基于染色解混的细胞分类

研究从EC和LEGH细胞的细胞质黏蛋白区域提取5x5像素块，计算各染料的相对丰度（某染料丰度/总丰度）。曼-惠特尼U检验显示，基于本研究RGB解混方法得到的EY和OG的相对丰度在EC和LEGH细胞间存在极显著差异（p<0.001），这与多光谱解混结果揭示的趋势一致：LEGH细胞胞质黏蛋白的EY相对丰度较低，而OG相对丰度较高，对应其肉眼观察到的黄色调。

进一步，使用线性判别分析（LDA）分类器，以相对染料丰度作为特征区分EC和LEGH细胞。结果表明，基于本研究RGB解混方法得到的EY和OG相对丰度特征，分类准确率达到98.0%，显著优于直接使用RGB强度、OD值或CIELAB颜色空间特征的分类器（准确率94.5%-96.5%），且非常接近基于多光谱解混结果的分类性能（99.5%）。这证实了该方法在量化染色和辅助诊断方面的有效性。

结论与意义

本研究成功开发了首个用于巴氏染色RGB图像的、无需训练的染色解混方法。通过引入加权核稀疏性这一新颖约束，结合非负性和全变分正则化，有效解决了染料数量超过图像通道数带来的解混难题。实验验证表明，该方法在染色定量准确性上优于现有方法，并能提取出具有临床鉴别意义的特征（EY和OG的相对丰度），成功用于区分癌前病变（LEGH）细胞与正常细胞，且分类准确率高。

这项工作的重要意义在于，它将主观的颜色印象转化为客观的、可量化的染料含量指标，为数字病理学，特别是宫颈细胞学筛查，提供了一种不依赖特殊成像设备（仅需常规RGB图像）的定量分析工具。该方法增强了诊断的客观性和可解释性，有望在计算细胞学中发挥重要作用，尤其在染料种类多于图像通道数的染色方案中具有广泛应用潜力。未来工作可集中于跨机构/染色方案的域适应、处理非线性效应以及拓展至更多下游任务（如细胞分割、癌症分型等），以推动其临床转化。