SLAP通过UBE3C介导mLST8非降解性泛素化调控mTORC2完整性抑制结直肠癌发生

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：SLAP controls mTORC2 integrity via UBE3C-mediated non-degradative mLST8 ubiquitination to suppress colorectal tumorigenesis

本研究针对mTORC2信号通路在结直肠癌(CRC)中过度激活但调控机制不明的难题，揭示了SLAP通过招募E3泛素连接酶UBE3C对mLST8进行K86/K215位点的非降解性泛素化修饰，从而破坏mTORC2复合物完整性并抑制其致癌活性。该发现不仅阐明了mTORC2异常激活的新机制，还为mTOR催化抑制剂(mTORCi)的精准治疗提供了潜在生物标志物。

　　

在结直肠癌研究领域，mTORC2（雷帕霉素机制靶点复合物2）信号通路的异常激活已被证实与肿瘤增殖、侵袭和耐药性密切相关，然而其精确的分子调控机制仍不明确。尤其值得注意的是，mTORC2的活性高度依赖于其核心组分（mTOR、RICTOR、SIN1和mLST8）的稳定组装，但这一过程如何在不同生理病理条件下被精细调控，特别是在癌症发生发展中如何失调，一直是困扰科学家的难题。与此同时，靶向mTOR通路的抑制剂在临床应用中疗效不一，部分原因在于对mTORC2特异性调控机制的认知不足。

为了深入探索mTORC2在结直肠癌中的调控新机制，由Rudy Mevizou和Dana Naim共同领导的研究团队将目光投向了SLAP（Src样适配蛋白）。SLAP作为酪氨酸激酶信号通路的负调控因子，在结直肠上皮组织中高表达，但其在mTORC2通路中的潜在作用尚未被揭示。研究人员首先通过SILAC（稳定同位素标记氨基酸细胞培养）互作组学分析，意外地发现SLAP与mTORC2复合物的多个组分存在特异性相互作用。这一发现提示SLAP可能直接参与mTORC2通路的调控。

在技术方法层面，本研究整合了多种关键技术：利用SILAC蛋白质互作组学筛选SLAP相互作用蛋白；通过免疫共沉淀和GST pull-down验证蛋白相互作用；采用点突变和泛素化修饰分析鉴定关键位点；使用邻近连接技术(PLA)在体外观测蛋白质相互作用；通过软琼脂克隆形成、Matrigel侵袭实验和裸鼠异种移植模型评估体内外肿瘤表型；并结合mTOR抑制剂处理实验探讨治疗意义。

SLAP与mTORC2特异性相互作用

研究人员在SW620结直肠癌细胞中过表达SLAP-Flag后进行SILAC分析，结果显示mTORC2的所有核心组分（mTOR、RICTOR、SIN1和mLST8）均与SLAP存在显著相互作用。通过免疫共沉淀实验在HT29和SW620细胞中进一步验证了SLAP与mTORC2各组分的直接结合。更重要的是，磷酸化蛋白芯片和Western blot分析表明，SLAP的表达特异性抑制了mTORC2下游底物（如pS473 AKT和pT346 NDRG1）的磷酸化水平，而对mTORC1信号通路无明显影响，证实了SLAP对mTORC2信号的特异性抑制作用。

mTORC2抑制介导SLAP的抗癌功能

通过功能实验，研究团队证实了mTORC2信号在SLAP介导的肿瘤抑制效应中的核心地位。在HCT116细胞中敲低SLAP可显著增强细胞的锚定非依赖性生长和侵袭能力，而这一促癌效应可被RICTOR（mTORC2特异性组分）的敲低所逆转，但不受RAPTOR（mTORC1特异性组分）敲低的影响。相反，在HT29细胞中过表达SLAP可抑制肿瘤细胞转化，而同时过表达RICTOR则能克服SLAP的抑制作用。这些结果明确表明SLAP通过抑制mTORC2信号发挥其抗癌功能。

SLAP通过靶向mLST8调控mTORC2复合物稳定性

机制探索发现，SLAP主要通过其SH3结构域与mLST8相互作用，进而影响mTORC2的完整性。当mLST8被siRNA敲低后，SLAP与RICTOR的结合显著减弱。功能上，过表达mLST8能够部分恢复被SLAP抑制的HT29和SW620细胞的生长和侵袭能力。尤为重要的是，SLAP并不影响mLST8的蛋白稳定性，而是通过破坏mLST8与RICTOR的结合来抑制mTORC2复合物的组装。免疫共沉淀和PLA实验均证实，SLAP表达可显著降低mLST8-RICTOR和mTOR-RICTOR的相互作用。

SLAP通过UBE3C介导mLST8泛素化调控复合物组装

深入研究揭示，SLAP通过招募E3泛素连接酶UBE3C，促进mLST8在K86和K215位点的非降解性泛素化修饰。这种泛素化修饰主要依赖于K29和K33泛素链连接方式，与传统的K48（降解性）泛素化不同。点突变实验表明，mLST8 K86R/K215R双突变体能抵抗SLAP诱导的mTORC2解聚。UBE3C的敲低可特异性逆转SLAP对mLST8泛素化和mTORC2组装的抑制作用，而其他E3连接酶（如TRAF2或TRIM32）则无此效果。

SLAP影响结直肠癌细胞对mTOR抑制剂的反应

临床意义方面，研究发现SLAP的表达水平与结直肠癌细胞对mTOR催化抑制剂（mTORCi）的敏感性密切相关。在SLAP低表达的细胞（如HT29、SW620）中，mTORCi（KU-0063794）表现出强烈的抗肿瘤效果；而在SLAP高表达的细胞（如HCT116）中，mTORCi反而可能产生 paradoxical（ paradoxical）的促进作用。动物实验进一步证实，在SLAP敲低的HCT116异种移植瘤中，mTORCi Torkinib（PP242）能够显著抑制肿瘤生长，并降低pS473 AKT水平，而在对照组中效果不明显。

本研究首次揭示了SLAP-UBE3C-mLST8轴在调控mTORC2复合物完整性和结直肠癌发生中的关键作用。该机制不仅丰富了我们对mTORC2通路调控网络的理解，更重要的是为mTOR靶向治疗提供了新的生物标志物和联合治疗策略。SLAP的表达水平可能成为预测mTORCi疗效的有力指标，为结直肠癌的精准治疗开辟了新途径。此外，该研究还拓展了我们对适配蛋白SLAP功能多样性的认识，表明其通过招募不同的泛素化因子（如CBL、UBE4A和UBE3C）实现对多种信号通路的精细调控。由于SLAP在多种癌症中均有表达，这一新发现的调控机制可能具有更广泛的肿瘤生物学意义和临床应用前景。