梨树病原菌Stemphylium vesicarium SVES21菌株的基因组序列草图

《Journal of Plant Pathology》：Draft genome sequence of the pear pathogen Stemphylium vesicarium strain SVES21

梨褐斑病菌SVES21菌株基因组测序及分析，揭示其遗传结构、致病基因和效应蛋白，为抗病育种和靶向 fungicide 设计提供依据。

　　

梨是一种全球广泛种植的水果作物，在国际市场上占有重要地位。根据联合国粮食及农业组织（FAOSTAT）的数据，2022年欧洲的梨产量接近200万吨，占全球总产量的9.1%。其中，意大利贡献了欧洲梨产量的11.7%。然而，意大利国家统计局（ISTAT）的数据显示，2006年至2024年间，意大利的梨种植面积减少了40%，收获量下降了52.7%。导致这一下降的主要因素之一是病害的压力。自1975年在意大利艾米利亚-罗马涅地区首次发现梨褐斑病以来，该病害已蔓延至多个欧洲国家，成为影响梨园的最严重真菌病害之一。这种由子囊菌门（Ascomycota）的Stemphylium vesicarium（Wallr.）E. Simmons菌引起的病害，给欧洲的梨种植区带来了巨大的经济损失（Llorente等人，2012年；Teufel等人，2022年）。在意大利北部，S. vesicarium病害尤为严重，迫使许多果园进行更换，凸显了需要更有效的管理策略的紧迫性。S. vesicarium SVES21菌株（也称为SVES）由维罗纳大学分离获得，最初于2022年在伦巴第大区布雷西亚的Castelletto地区从梨果实（Pyrus communis cv Abate Fétel）中分离出来。通过单孢子培养建立了该菌株的纯培养物。该菌株在番茄汁培养基（200毫升番茄汁、4克碳酸钙、15克琼脂和800毫升水）中生长，其DNA使用Wizard?基因组DNA纯化试剂盒（Promega）提取。通过凝胶电泳、分光光度法和荧光定量技术评估了DNA的产量、纯度和完整性。

该基因组使用Illumina NovaSeq 6000双端测序系统进行测序。我们使用FastQC v0.11.7（Andrews，2010年）评估序列质量，并利用Trimmomatic v0.40（Bolger等人，2014年）去除接头序列，根据质量评分进行序列修剪（ILLUMINACLIP参数：TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50）。基因组组装使用SPAdes v3.15.5（Prjibelski等人，2020年）完成，移除了覆盖度低于1/10或长度小于350 bp的支架序列，并屏蔽了线粒体DNA和rRNA簇等高度重复的基因组元件。基因组完整性通过BUSCO v5.7.1（Manni等人，2021年）进行评估，组装统计信息则使用QUAST v5.2.0（Mikheenko等人，2018年）计算。SVES21基因组的初步草图包含2,470个支架，总长度为36.3 Mbp，N50值为66,772，L50值为151（见表1），与菌株173-1a13FI1M3的基因组组装结果相似（Gazzetti等人，2019年）。该基因组的GC含量为51.67%，最大支架长度为471,441 bp。完整性评估结果显示，基因组完整性为98.30%（其中单拷贝基因占98.2%，重复基因占0.1%，片段化基因占0.4%，缺失基因占1.3%，总检测到的基因组片段数为6,641个）。对感染的梨叶片进行了RNA-seq分析，测序同样使用Illumina NovaSeq 6000双端系统。接头序列的去除采用Trimmomatic v0.40（Bolger等人，2014年）完成，转录本组装使用rnaSPAdes（Bushmanova等人，2019年）软件。组装后的转录本通过Geneious Prime 2024.0中的“Map to Reference”工具（https://www.geneious.com）映射到SVES21菌株的基因组上。将得到的转录本数据与173-1a13FI1M3菌株的基因组数据结合，使用AUGUSTUS v3.5.0（Hoff和Stanke，2013年）训练基因预测模型，同时利用GeneMark-ES v4.72（Ter-Hovhannisyan等人，2008年）进行从头基因预测。结合转录组信息，通过MAKER v3.01.02（Cantarel等人，2008年）流程预测出11,025个蛋白质编码基因。

表1 Stemphylium vesicarium SVES21和173-1a13FI1M3基因组的统计信息

完整表格

使用SignalP v6.0（Teufel等人，2022年）预测的分泌蛋白。为进一步验证预测结果，采用DeepLoc 2.1（?dum等人，2024年）验证了这些蛋白质的细胞外定位，共鉴定出555个候选分泌蛋白。DeepTMHMM 1.0.42（Hallgren等人，2022年）用于排除具有跨膜结构的蛋白质，PredGPI（Pierleoni等人，2008年）用于去除GPI锚定蛋白。最终得到的分泌蛋白集合通过EffectorP-fungi 3.0（Sperschneider和Dodds，2022年）进行分析，其中202个候选蛋白被鉴定为细胞质蛋白，141个为细胞外蛋白。

该基因组草图是目前第二个公开的基因组资源。对这种病原体的基因组进行测序是控制梨褐斑病的关键步骤，为早期病原体检测提供了重要的诊断工具。此外，它还揭示了对其宿主的进化适应机制，有助于未来感染预测和抗病品种的培育。该基因组还有助于识别关键致病基因，从而设计出针对病原体的杀菌剂。这一基因组资源还有助于比较研究，为探索植物-病原体相互作用奠定基础，显著促进了梨生产的稳定。

目前，关于梨源的基因组资源非常有限，迄今为止仅有两个菌株被测序。这一限制阻碍了比较基因组学的研究，也妨碍了寻找与病原体毒力和宿主适应性相关的基因的工作。应优先扩大这些基因组资源的收集范围，系统性地从不同地理区域收集并测序该病原体样本。将这些基因组数据与转录组和代谢组分析相结合，可以全面了解真菌感染的生物学机制。这种方法有助于发现关键的抗性基因，阐明新的致病因子，并最终指导梨栽培及其他领域的可持续病害管理策略的制定。