氧固醇通过GPR183信号通路调控肠道炎症的性别差异性研究

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Oxysterol-mediated modulation of intestinal inflammation: insights into sex differences and GPR183 signaling

本研究聚焦炎症性肠病（IBD）中氧固醇的免疫调节作用及其性别差异。研究人员通过DSS诱导的小鼠结肠炎模型、结肠外植体、类器官及多种细胞模型，揭示了关键氧固醇（7α,25-二羟基胆固醇、25-羟基胆固醇-3-硫酸酯等）在雌性小鼠中表现出更强的抗炎效应，并发现GPR183信号通路在免疫细胞迁移中的重要作用。该研究为理解IBD的性别差异提供了新的脂质介质视角，为靶向氧固醇通路治疗IBD提供了理论依据。

　　

炎症性肠病（IBD）作为一种慢性复发性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），其全球发病率呈持续上升趋势。尽管现有治疗手段能够在一定程度上控制症状，但远未达到根治效果，且部分患者会面临严重不良反应的困扰。更为有趣的是，临床观察发现IBD的发病率和疾病特征存在明显的性别差异，这提示我们性别特异性因素可能在疾病发生发展中扮演着重要角色。在这一背景下，胆固醇的氧化代谢产物——氧固醇（oxysterols），因其复杂的免疫调节功能而日益受到关注。这些脂质介质如同双刃剑，在不同环境和细胞类型中既可促进也可抑制炎症反应，但其在IBD中的具体作用机制，特别是是否存在性别差异性调控，仍是一个亟待阐明的科学问题。

发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》的这项研究，正是为了深入探索氧固醇在肠道炎症中的调控作用及其潜在的性别差异。研究人员选取了四种关键氧固醇：25-羟基胆固醇（25HC）、25-羟基胆固醇-3-硫酸酯（25HC3S）、7α,25-二羟基胆固醇（7α25HC）和4β-羟基胆固醇（4βHC）作为研究对象，它们分别通过作用于肝脏X受体（LXR）、G蛋白偶联受体183（GPR183）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和视黄酸相关孤儿受体γt（RORγt）等关键分子来调节免疫反应。

为了系统回答上述问题，研究团队运用了多层次的研究策略。在整体动物水平，他们采用了葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性结肠炎模型，并特别设计了同时包含雄性和雌性小鼠的实验组别，以直接比较性别差异。在组织水平，建立了结肠外植体（colon explants）离体培养系统，用于评估氧固醇对完整结肠组织炎症反应的直接调控。在细胞水平，则利用了三种重要的体外模型：小鼠结肠类器官（colon organoids），用于模拟肠道上皮的复杂结构和功能；人单核细胞系THP-1来源的巨噬细胞，用于研究对天然免疫细胞的影响；人外周血单核细胞（PBMC），用于评估氧固醇对混合免疫细胞群体的作用；以及人结肠腺癌细胞系Caco-2，用于研究对肠道上皮屏障功能的影响。关键技术方法还包括：通过高效液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）精确定量组织和血浆中的多种氧固醇含量；通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）分析基因表达和细胞因子水平；通过流式细胞术（flow cytometry）分析免疫细胞亚群的变化；以及通过主成分分析（PCA）等生物信息学方法处理多维数据。

DSS诱导的结肠炎以性别差异性方式改变炎症状态和氧固醇水平

研究人员首先证实了DSS诱导的结肠炎成功建立，表现为体重下降、结肠重量/长度比增加以及髓过氧化物酶（MPO）活性升高。重要的是，他们发现雌性小鼠对DSS诱导的炎症表现出更强的抵抗力，其结肠组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的基因表达以及白介素-6（IL-6）的蛋白水平均低于雄性小鼠。对结肠组织氧固醇的分析揭示了显著的性别差异：在基础状态下，雌性小鼠结肠中的7-酮基胆固醇（7KC）、5α,6α-环氧胆固醇和5β,6β-环氧胆固醇水平低于雄性；在DSS炎症状态下，雌性小鼠结肠中的7-羟基胆固醇（7HC）和7-酮基-25-羟基胆固醇（7K25HC）水平较低，而24(S)-羟基胆固醇和27-羟基胆固醇（27HC）水平较高。主成分分析（PCA）显示，DSS处理（PC1，54.8%方差）和性别（PC2，25%方差）是导致氧固醇谱差异的两个主要因素。相关性分析进一步表明，在雄性小鼠中，单羟基化氧固醇（如4βHC、7HC、25HC、7K25HC）的水平与TNF-α、MCP-1和IL-6等炎症标志物显著相关，而在雌性小鼠中，这种相关性较弱，可能与雌性小鼠整体炎症水平较低有关。此外，炎症状态下，氧固醇代谢酶CYP7B1和胆固醇-25-羟化酶（CH25H）的mRNA表达上调，而羟基-Δ-5-类固醇脱氢酶（HSD3B7）表达下调，且这些变化与炎症标志物存在显著相关性。血浆氧固醇分析也观察到类似的性别差异和DSS诱导的变化。这些结果共同表明，肠道炎症背景下，氧固醇的代谢和功能存在显著的性别特异性调控。

氧固醇在离体结肠组织中降低炎症水平

为了更直接地评估氧固醇的抗炎潜力，研究团队利用DSS处理小鼠的结肠外植体进行了离体实验。结果显示，25HC3S和7α25HC能够显著降低雌性小鼠结肠外植体培养上清中MCP-1和IL-6的产生，但在雄性小鼠中效果不明显。这一发现提示这些氧固醇的抗炎作用具有性别偏好性。为了区分氧固醇对上皮细胞和免疫细胞的不同影响，研究人员进一步使用了结肠类器官和Caco-2细胞模型。在LPS和IFNγ刺激的结肠类器官中，高浓度（10μM）的7α25HC显示出降低巨噬细胞炎症蛋白-2α（Mip2α）基因表达和TNF-α蛋白水平的趋势。然而，在细胞因子和LPS诱导炎症的Caco-2细胞单层模型中，所测试的氧固醇对上皮屏障通透性（通过跨上皮电阻TEER评估）或IL-8分泌均无显著影响。这表明氧固醇的抗炎作用可能更主要地体现在免疫细胞层面，而非直接作用于上皮细胞。

氧固醇降低THP-1来源的巨噬细胞的活化，但对人PBMC无显著影响

接下来，研究聚焦于免疫细胞。在THP-1来源的巨噬细胞中，LPS和IFNγ刺激强烈诱导了IL-6和TNF-α的分泌，而4βHC、25HC3S和7α25HC均能以剂量依赖的方式抑制这种促炎反应。同时，巨噬细胞分化（PMA处理）和激活（LPS+IFNγ）显著改变了多种氧固醇受体（LXRα、LXRβ、PPARγ、GPR183）的表达模式。为了探究分子机制，研究人员使用了受体拮抗剂。然而，PPARγ拮抗剂T0070907并不能逆转25HC3S的抗炎效应；同样，两种GPR183拮抗剂（NIBR189和GSK682753A）也未能拮抗7α25HC的作用，其中GSK682753A本身甚至表现出与7α25HC类似的抗炎效果。这些结果虽然未能明确其作用的特异性受体，但进一步支持了这些氧固醇具有抗炎特性。相比之下，在从健康志愿者血液分离的PBMC中，无论是以LPS（主要激活单核细胞）还是植物血球凝集素（PHA，主要激活淋巴细胞）进行刺激，四种氧固醇对炎症因子（TNF-α、IL-6、IFNγ、IL-13）的产生均未表现出稳定一致的抑制作用，仅在高浓度25HC和7α25HC下对PHA激活的PBMC有轻微的抑制趋势。值得注意的是，LPS和PHA激活对PBMC中氧固醇受体的表达谱产生了不同的影响。

7α25HC和GPR183拮抗在DSS诱导的结肠炎中具有性别特异性的免疫调节作用

鉴于结肠炎模型中7α25HC合成通路（CH25H和CYP7B1）被显著激活，且与疾病程度相关，研究人员在体内评估了外源性补充7α25HC及其受体GPR183拮抗剂NIBR189对DSS结肠炎的影响。结果显示，无论是单独使用7α25HC、NIBR189，还是两者联合使用，对小鼠的体重变化、结肠重量/长度比、组织学评分等宏观和微观结肠炎指标均无显著改善。在炎症标志物方面，7α25HC仅在雄性小鼠中轻微降低了结肠MPO活性，并呈现降低IL-6水平的趋势（p=0.08），在其他指标上效果甚微。然而，对肠系膜淋巴结免疫细胞的流式细胞分析揭示了更为有趣的现象：在雄性小鼠中，7α25HC处理降低了巨噬细胞和树突状细胞的数目；在雌性小鼠中，7α25HC处理则广泛降低了单核细胞、树突状细胞、B细胞、CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞等多个免疫细胞亚群的数目。在雌性小鼠中，NIBR189能够部分阻断7α25HC对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞数目的影响，但对髓系单核细胞的影响无拮抗作用。这些数据表明，7α25HC在体内的主要效应可能是改变了免疫细胞在淋巴组织中的迁移和分布，而非直接抑制炎症，且这种效应存在性别差异，并部分依赖于GPR183。

讨论与结论

本研究的重要发现在于揭示了氧固醇代谢及其抗炎作用在肠道炎症中存在显著的性别二态性。雌性小鼠不仅对DSS结肠炎具有更强的抵抗力，其结肠组织对特定氧固醇（如25HC3S和7α25HC）的抗炎反应也更为敏感。这种差异可能与性激素对胆固醇稳态和氧固醇代谢酶（如CYP7B1）的调控有关。研究观察到炎症过程中7α25HC代谢通路的协调性变化：合成酶CH25H和CYP7B1与炎症正相关，而降解酶HSD3B7与炎症负相关，提示机体存在精细的反馈调节机制。虽然本研究未能直接检测到结肠组织中7α25HC的水平，但该通路在炎症中的激活及其与GPR183的相互作用已被前人研究证实，其在免疫细胞定向迁移中起关键作用。

体外实验证实了7α25HC和25HC3S在巨噬细胞中的抗炎潜力，但未能明确其受体机制，拮抗剂实验的结果提示可能需要更优化的给药策略或存在其他未知靶点。相比之下，氧固醇在PBMC中的效果微弱，这可能与细胞群体的异质性、受体表达差异或供体来源（健康人）有关，未来研究有必要使用IBD患者来源的PBMC进行验证。

体内研究的结果颇具启发性。外源性7α25HC未能显著改善DSS结肠炎的经典病理指标，但却显著改变了肠系膜淋巴结的免疫细胞组成，这强烈暗示其生理作用更侧重于调节免疫细胞的“位置”（trafficking），而非直接“灭火”（抗炎）。这种药理学干预（腹腔注射高剂量7α25HC）所创造的浓度梯度，可能与内源性、局部产生的7α25HC所形成的生理性化学梯度有所不同，这或许是体内外结果差异的重要原因。此外，GPR183受体在激动剂持续存在下会发生脱敏，这也增加了其在慢性炎症中作用的复杂性。本研究首次在结肠炎模型中同时使用了7α25HC和其受体拮抗剂进行药理学干预，其结果与某些基因敲除模型的研究结论（GPR183或CH25H缺失不影响DSS结肠炎严重程度）有相似之处，但也揭示了性别特异性的免疫细胞调节模式，为理解该通路的复杂性提供了新的维度。

综上所述，该项由Hafsa Ameraoui、Joan Bestard-Escalas、Martin Roumain等研究人员完成的工作，系统地阐明了氧固醇在肠道炎症中的性别差异性调控作用，突出了GPR183信号通路在免疫细胞迁移中的潜在功能。这些发现强调了将性别作为生物学变量纳入IBD研究的重要性，并为开发针对氧固醇通路的新型性别特异性治疗策略奠定了坚实的理论基础。