环状RNA hsa_circ_0000437通过调控let-7f-5p/RALB轴激活MAPK信号通路促进风湿性心脏瓣膜病进展的机制研究

《Human Cell》：Hsa_circ_0000437 promotes the progression of rheumatic valvular heart disease by activating the mitogen-activated protein kinase signaling pathways after sponging let-7f-5p and targeting RAS-like proto-oncogene B

本研究针对风湿性心脏瓣膜病（RVHD）缺乏早期诊断标志和精准治疗靶点的临床难题，聚焦环状RNA hsa_circ_0000437的功能机制。团队通过circRNA微阵列筛选、蛋白质组学分析和功能验证，首次揭示hsa_circ_0000437通过吸附let-7f-5p上调RALB表达，激活MAPK信号通路，促进瓣膜间质细胞增殖/迁移并抑制凋亡的新机制。该轴心具有0.998的联合诊断效能，为RVHD的早期干预提供了新型生物标志物和潜在治疗靶点。

　　

在全球范围内，风湿性心脏瓣膜病（Rheumatic Valvular Heart Disease, RVHD）的发病率和死亡率虽呈下降趋势，但在中国、印度等发展中国家仍造成重大疾病负担。这种由A组β溶血性链球菌感染引发的自身免疫性疾病，会导致心脏瓣膜结构和功能进行性损害。然而，RVHD早期临床表现隐匿，缺乏特异性诊断标志物，当患者出现瓣膜狭窄或关闭不全症状时，往往只能通过药物或手术干预，至今仍缺乏精准的治疗靶点。

近年来，环状RNA（circular RNAs, circRNAs）作为一类具有闭合环状结构的非编码RNA分子，因其较线性RNA更高的稳定性，在心血管疾病领域展现出巨大研究价值。它们可通过竞争性结合微小RNA（microRNA）、调控转录翻译等机制参与疾病进程，但circRNAs在RVHD中的作用机制尚不明确。

在这项发表于《Human Cell》的研究中，宁波大学附属李惠利医院心血管外科孙乐波教授团队联合多个研究中心，通过整合circRNA微阵列、蛋白质组学和功能实验，系统揭示了hsa_circ_0000437/let-7f-5p/RAS样原癌基因B（RAS-like proto-oncogene B, RALB）轴通过激活丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK）信号通路促进RVHD进展的新机制。

研究团队首先对3对RVHD患者和健康对照者的血浆样本进行circRNA微阵列分析，从9295个circRNAs中筛选出81个差异表达分子。其中hsa_circ_0000437在前期研究中已被证实可作为RVHD的诊断标志物。本研究进一步通过生物信息学预测、无标记蛋白质组学和平行反应监测（Parallel Reaction Monitoring, PRM）技术，锁定hsa_circ_0000437的靶向结合蛋白为RALB。同时利用RNA pull-down和RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP）实验验证了hsa_circ_0000437与let-7f-5p及RALB之间的直接结合关系。

关键技术方法包括：对42例RVHD患者、42例非风湿性瓣膜病（Non-Rheumatic Valvular Disease, NRVD）患者和42例健康对照的血浆样本进行circRNA微阵列筛查和qRT-PCR验证；通过PRM技术和RNA pull-down/RIP实验鉴定RNA-蛋白质相互作用；利用双荧光素酶报告基因系统验证结合位点；在永生化人瓣膜间质细胞（human Valve Interstitial Cells, hVICs）中通过功能回复实验探讨生物学功能；采用Western blotting分析MAPK信号通路关键蛋白表达。

表达谱分析与诊断价值验证

circRNA微阵列的火山图、聚类热图和散点图一致显示hsa_circ_0000437在RVHD患者中显著高表达。临床样本扩大验证发现let-7f-5p在RVHD组表达最低，与hsa_circ_0000437呈显著负相关（r=-0.82, P<0.001），而RALB表达趋势与hsa_circ_0000437一致。诊断价值评估显示，let-7f-5p单独诊断RVHD的曲线下面积（Area Under the Curve, AUC）为0.921，而与hsa_circ_0000437联合诊断时AUC高达0.998，灵敏度0.945，特异度0.963。

ceRNA调控机制解析

双荧光素酶报告基因实验证实hsa_circ_0000437与let-7f-5p存在特异性结合位点。功能实验表明，过表达hsa_circ_0000437可逆转let-7f-5p对hVICs细胞增殖、迁移和细胞周期的抑制作用，并拮抗其促凋亡效应。RNA pull-down和RIP实验进一步验证了hsa_circ_0000437与RALB的直接结合，从而完善了"hsa_circ_0000437吸附let-7f-5p→解除对RALB的抑制→激活下游信号通路"的ceRNA调控轴。

MAPK信号通路激活机制

Western blotting结果显示，沉默hsa_circ_0000437可降低RALB、MAPK14和细胞外调节蛋白激酶（Extracellular Regulated Protein Kinases, ERK）表达，同时升高c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase, JNK）水平；过表达实验呈现相反趋势。值得注意的是，let-7f-5p模拟物可逆转hsa_circ_0000437对MAPK通路的激活作用，而RALB沉默则显著抑制该效应。这些结果证实hsa_circ_0000437/let-7f-5p/RALB轴通过调控MAPK14/ERK（正向调控）和JNK（负向调控）的平衡，驱动瓣膜间质细胞的炎症转化和病理性重塑。

研究结论表明，hsa_circ_0000437作为ceRNA竞争性结合let-7f-5p，解除其对RALB的抑制作用，进而激活MAPK信号通路，促进瓣膜间质细胞的增殖、迁移和细胞周期进程，抑制细胞凋亡，最终驱动RVHD的病理进展。这一新机制的发现不仅为理解RVHD的发病机制提供了新视角，更重要的是揭示了具有0.998 AUC值的联合诊断标志物，以及潜在的干预靶点。尽管尚未进行动物模型验证，该研究为开发RVHD的早期诊断方法和靶向治疗策略奠定了坚实的理论基础。