靶向RAS-MAPK通路缓解神经纤维瘤病1型小鼠脊柱畸形的机制研究

《Bone Research》：Pharmacological inhibition of RAS pathway alleviates spine deformity in a mouse model of neurofibromatosis type 1

本研究针对神经纤维瘤病1型（NF1）中脊柱畸形发病机制不明的临床难题，通过Prss56-Nf1基因敲除（KO）小鼠模型，首次揭示Prss56谱系来源的成骨细胞是NF1脊柱畸形的细胞起源。研究人员发现Nf1缺失导致成骨细胞RAS-MAPK信号通路过度激活，引起椎骨小梁骨量异常增加和脊柱后凸。更重要的是，联合使用MEK抑制剂selumetinib和SHP2抑制剂RMC-4550能有效预防脊柱畸形进展，为NF1脊柱病变提供了新的治疗策略。该成果发表于《Bone Research》期刊。

　　

神经纤维瘤病1型（Neurofibromatosis type 1, NF1）是一种影响1/3000人群的常染色体显性遗传病，由NF1肿瘤抑制基因突变导致神经纤维蛋白功能缺失，进而引起RAS-丝裂原活化蛋白激酶（RAS-MAPK）信号通路过度活化。患者除出现皮肤色素斑、神经纤维瘤等典型症状外，超过半数会伴发骨骼异常，其中脊柱畸形（包括脊柱侧凸和后凸）是最常见的骨骼表现，严重影响儿童和青少年的生活质量。

尽管脊柱畸形在NF1患者中发生率高达10%-69%，但其发病机制一直不明。传统观点认为脊柱畸形可能与椎旁丛状神经纤维瘤（paraspinal plexiform neurofibromas, ppNFs）的机械压迫有关，但临床观察发现部分患者在不伴有ppNFs的情况下仍会出现脊柱畸形，提示细胞内在缺陷可能发挥关键作用。由于缺乏能同时模拟NF1多系统症状的动物模型，脊柱畸形的细胞起源和分子机制研究进展缓慢。

为解决这一难题，法国巴黎东克雷泰伊大学的研究团队利用能模拟多种NF1症状的Prss56-Nf1 KO小鼠模型开展研究。该模型通过在表达Prss56的边界帽细胞（boundary cap cells, BC cells）及其衍生物中特异性敲除Nf1基因，成功再现了神经纤维瘤、胫骨假关节以及脊柱畸形等NF1典型症状。

关键技术方法

研究采用Prss56-Nf1基因敲除小鼠模型，通过微型计算机断层扫描（micro-CT）量化脊柱角度变化，利用谱系追踪技术标记Prss56表达细胞及其后代，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析椎骨细胞群体的转录组特征，并通过免疫荧光染色验证信号通路活性。药理学干预实验使用MEK抑制剂selumetinib和SHP2抑制剂RMC-4550进行联合治疗。

Prss56-Nf1 KO小鼠重现NF1脊柱畸形

研究人员通过micro-CT分析发现，Prss56-Nf1基因敲除小鼠从12月龄开始出现进行性脊柱侧凸（弯曲角度≥10°）和脊柱后凸，其发生率与人类NF1患者相似。此外，突变小鼠椎骨出现椎间盘融合、椎体楔形变、扇贝样改变等结构异常，这些表型与NF1患者的脊柱病变高度一致。值得注意的是，椎间盘融合在3月龄时即可检测到，早于明显脊柱畸形的出现，提示椎骨发育早期即存在异常。

Nf1缺陷的成骨细胞在Prss56-Nf1 KO小鼠椎骨中增多

通过tdTomato报告基因追踪Prss56谱系细胞，研究发现这些细胞在胚胎期E12.5开始参与椎骨形成，主要分化为SOX9⁺软骨细胞和OSX⁺成骨细胞/骨细胞。与对照组相比，突变小鼠椎骨中tdTomato⁺信号显著增加，且不规则分布，尤其在T11-L2节段的小梁骨区域最为明显。免疫荧光染色证实，突变小鼠椎骨中tdTomato⁺OSX⁺成骨细胞/骨细胞数量显著增加。

Nf1缺陷的成骨细胞表现出成骨分化改变和RAS-MAPK过度激活

单细胞RNA测序分析揭示了Prss56-Nf1突变小鼠椎骨中多种细胞群体的转录组变化。基因本体（GO）分析显示，突变成骨细胞中与结缔组织发育、骨化和成骨分化相关的基因集显著富集。具体而言，细胞外基质重塑基因（Adamts9、Adamts1、Mmp2）表达下调，而成骨分化相关基因（Tgfbr3、Igf1r、Zbtb16）表达上调。突变骨细胞中早期成骨标志物（Alpl、Ibsp）表达增加，而晚期成熟标志物（Bglap、Dmp1）表达下降，提示成骨分化成熟过程受阻。组织形态计量学分析进一步证实突变小鼠椎骨中类骨质表面增加，表明骨矿化受损。

同时，突变细胞中增殖和MAPK信号通路活性评分显著升高。免疫荧光染色显示，突变小鼠椎骨中tdTomato⁺pERK⁺和tdTomato⁺Ki67⁺细胞比例增加，证实RAS-MAPK通路过度活化和细胞增殖增强。

Nf1缺陷成骨细胞数量增加与椎骨参数改变和脊柱后凸相关

组织学分析显示，突变小鼠椎骨中OSX⁺衬里成骨细胞和tdTomato⁺OSX⁺衬里成骨细胞数量显著增加，同时破骨细胞数量也有所增加，但成骨细胞/破骨细胞比率仍高于对照组，表明骨形成大于骨吸收。高分辨率micro-CT扫描显示突变小鼠椎骨小梁骨体积分数（BV/TV）增加，而皮质骨参数无变化。重要的是，小梁骨量增加与tdTomato⁺信号强度呈正相关，且两者均与脊柱后凸角度显著相关。

椎旁丛状神经纤维瘤的存在与脊柱畸形无关

尽管Prss56-Nf1 KO小鼠能重现椎旁丛状神经纤维瘤（ppNFs），但分析显示伴有或不伴有ppNFs的突变小鼠在脊柱畸形发生率上无显著差异，表明ppNFs不是驱动脊柱畸形的必要因素。

联合MEK和SHP2抑制预防Prss56-Nf1 KO小鼠脊柱畸形

为探索治疗策略，研究人员在6月龄Prss56-Nf1突变小鼠脊柱畸形发生初期，联合使用MEK抑制剂selumetinib和SHP2抑制剂RMC-4550进行干预。结果显示，联合治疗能有效预防脊柱侧凸和脊柱后凸的进展，显著降低椎骨中tdTomato⁺信号强度。机制上，治疗减少了tdTomato⁺pERK⁺细胞比例，同时增加了tdTomato⁺Cleaved Caspase3⁺细胞比例，表明通过抑制RAS-MAPK通路并诱导细胞凋亡发挥了治疗作用。

研究结论与意义

本研究首次明确了Prss56谱系来源的成骨细胞是NF1脊柱畸形的细胞起源，揭示了Nf1缺失通过持续激活RAS-MAPK通路，导致成骨细胞增殖增加、分化异常和椎骨小梁骨量失衡，最终引起脊柱畸形的分子机制。更重要的是，研究证实联合靶向MEK和SHP2能有效预防脊柱畸形进展，为NF1脊柱病变的临床治疗提供了新策略。

该研究的创新性在于利用能模拟NF1多系统症状的Prss56-Nf1 KO小鼠模型，解决了以往模型无法重现疾病复杂性的难题。发现神经嵴来源的边界帽细胞不仅参与神经纤维瘤形成，还贡献于椎骨发育，拓展了对神经嵴细胞分化潜能的认知。研究结果强调了针对特定细胞类型中信号通路异常进行治疗的重要性，为NF1及其他RASopathies（RAS通路病）相关骨骼畸形的精准治疗奠定了基础。