胰腺癌中表达转胶蛋白的肌成纤维样癌相关成纤维细胞通过塑造免疫抑制微环境促进肿瘤进展

《British Journal of Cancer》：Transgelin defines pro-tumorigenic cancer-associated fibroblasts in pancreatic cancer

本研究聚焦胰腺导管腺癌(PDAC)中癌相关成纤维细胞(CAF)的异质性难题。研究人员通过单细胞ATAC-seq和RNA-seq技术，深入解析了肌成纤维样CAF(myCAF)亚群，发现转胶蛋白(TAGLN)阳性myCAF是驱动肿瘤进展的关键亚群。功能实验证实，靶向Tagln可显著抑制肿瘤生长、减少胶原沉积并逆转免疫抑制微环境。该研究为PDAC的基质靶向治疗提供了新的潜在靶点。

　　

胰腺导管腺癌（PDAC）是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，其五年生存率仅为9%，预后极差。这种疾病的显著特征之一是肿瘤组织中存在大量的间质成分，即所谓的“间质反应”，其中癌相关成纤维细胞（CAFs）是这种间质的主要构成者，可占肿瘤基质总量的90%。传统的观点将CAFs大致分为几类：靠近癌细胞的肌成纤维样CAFs（myCAFs），其标志物包括α-平滑肌肌动蛋白（αSMA或ACTA2）和转胶蛋白（TAGLN）；远离癌细胞的炎症性CAFs（iCAFs），表达白细胞介素6（IL-6）等炎症因子；以及主要在小鼠模型中发现的抗原呈递CAFs（apCAFs）。随着肿瘤进展，myCAFs的比例会逐渐增加，并且高表达αSMA的基质活性通常预示着患者的不良预后。然而，针对αSMA阳性CAFs的治疗尝试却得到了矛盾的结果，这提示myCAFs群体内部可能存在巨大的功能异质性，既包含促肿瘤的亚群，也可能存在抑肿瘤的亚群。因此，深入解析myCAFs的异质性，识别其中关键的促肿瘤亚群并阐明其作用机制，对于开发有效的PDAC治疗策略至关重要。

发表在《British Journal of Cancer》的这项研究，正是为了解开myCAFs异质性这个黑匣子。研究人员利用能够模拟人类PDAC基因特征的KPC（LSL-Kras^G12D/+; LSL-Trp53^R172H/+; Pdx-1-Cre）小鼠模型，结合前沿的单细胞技术，旨在描绘出myCAFs的精细图谱，并找到驱动肿瘤恶化的“罪魁祸首”。

为了开展这项研究，作者团队运用了几个关键技术方法。他们首先对KPC小鼠和野生型小鼠的胰腺组织进行了单细胞ATAC测序（scATAC-seq）和单细胞RNA测序（scRNA-seq），以从表观遗传和转录组水平刻画细胞异质性。他们建立了Tagln基因敲除（Tagln^-/-）小鼠的原位胰腺癌模型，并通过皮下共移植模型（将小鼠PDAC细胞系mT5与癌相关成纤维细胞CAFs共注射）来评估Tagln在体内的功能。细胞功能实验包括Transwell迁移/侵袭实验以及用条件培养基（CM）处理来研究细胞间相互作用。此外，还通过免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）和Masson三色染色等技术对小鼠和人类PDAC组织样本（包括来自TCGA数据库和Nagoya大学医院的样本）进行了组织学分析。

scATAC-seq identified four distinct subpopulations of CAFs in KPC mice

研究人员首先对来自两只3月龄KPC小鼠和一只野生型小鼠的胰腺组织进行了scATAC-seq分析，获得了2880个高质量细胞的染色质可及性图谱。通过聚类分析，他们鉴定出7种主要的细胞类型，其中包括两个成纤维细胞簇（C2和C5）。进一步对成纤维细胞进行亚聚类后，发现了四个不同的亚群（F1-F4）。基因活性评分显示，F1高表达iCAF的标志基因（如Il6），而F2、F3和F4则高表达myCAF的标志基因（如Acta2和/或Tagln）。值得注意的是，在Tagln和Acta2基因位点的染色质开放状态上，这些亚群表现出差异：F2和F3是Acta2开放/Tagln开放的myCAF，而F4则是Acta2开放/Tagln关闭的myCAF。转录因子（TF）结合基序富集分析进一步揭示了各亚群的特性：F1（iCAF）富集Stat3 motif；F2富集Prrx1 motif；F3富集Smad4 motif；而F4则富集Srf和Cebpb motif。这些表观遗传特征表明，myCAF群体内部存在显著的异质性，并由不同的转录程序所调控。

Analysis of transcriptional programs in CAFs from KPC mouse models

接下来，研究者通过scRNA-seq分析了两只KPC小鼠和两只野生型小鼠胰腺组织的17843个高质量细胞的转录组。他们鉴定出11个细胞簇，其中包括一个正常成纤维细胞簇（C1，主要来自野生型小鼠）和三个CAF亚群：iCAF（C2）、apCAF（C3）和myCAF（C4）。对myCAF簇（C4）的深入分析进一步识别出三个转录不同的亚簇：C4_1， C4_2和C4_3。每个亚簇都富集了不同的转录因子、通路相关基因和细胞因子。例如，C4_2高表达Tgfbr2和Smad2；C4_3高表达Tgfb3；而C4_1则高表达Srf的下游靶基因如Myh9和Itga1。这些转录特征与scATAC-seq发现的表观遗传亚群（F2, F3, F4）高度对应。为了验证小鼠模型中的发现在人类中的相关性，研究者分析了公共数据库（GSE155698）中人类PDAC的scRNA-seq数据，同样在myCAF中发现了三个类似的亚簇，并且ACTA2和TAGLN的表达呈显著正相关（r=0.75），但确实存在只表达其中一个基因的细胞亚群，这进一步证实了myCAF的异质性。

Tagln in CAFs drives migration, invasion, and proliferation of human PDAC cells

基于上述发现，Tagln被确定为myCAF中的一个关键候选基因。为了探究Tagln在CAFs中的具体功能，研究者将小鼠PDAC细胞系mT5原位植入Tagln^+/+（野生型）和Tagln^-/-小鼠的胰腺中，并从中分离出CAFs进行功能实验。Transwell迁移实验表明，在与PDAC细胞（如Panc-1）共培养时，Tagln^+/+CAFs的迁移能力显著强于Tagln^-/-CAFs。更重要的是，Panc-1或BxPC-3等PDAC细胞在与Tagln^+/+CAFs共培养后，其迁移和侵袭能力也显著增强。此外，用Tagln^+/+CAFs的条件培养基（CM）培养的PDAC细胞，其增殖速度也更快。细胞骨架染色显示，Tagln^-/-CAFs的F-肌动蛋白（F-actin）骨架排列紊乱，而Tagln^+/+CAFs则具有排列整齐、方向一致的纤维结构，提示Tagln对于维持CAFs的细胞骨架结构和功能至关重要。

Impact of Tagln-positive CAFs on PDAC progression in vivo

为了评估Tagln阳性CAFs在体内的促瘤作用，研究者将mT5细胞与Tagln^+/+CAFs或Tagln^-/-CAFs以1:3的比例混合后，皮下注射到Tagln^-/-受体小鼠体内。结果显示，与Tagln^-/-CAFs共移植的肿瘤体积显著大于与Tagln^-/-CAFs共移植的肿瘤。对肿瘤组织的分析发现，含有Tagln^+/+CAFs的肿瘤中胶原沉积和CD206⁺M2型巨噬细胞的浸润均显著增加。

在更接近临床实际情况的原位移植模型中，将mT5细胞单独植入Tagln^+/+和Tagln^-/-小鼠的胰腺。三周后，Tagln^+/+小鼠的肿瘤重量显著高于Tagln^-/-小鼠。组织学分析再次证实，Tagln^+/+小鼠的肿瘤中胶原沉积更多。尤为重要的是，Tagln^-/-小鼠的肿瘤微环境发生了显著改变：CD4⁺和CD8⁺T细胞的浸润明显增加，而CD206⁺M2型巨噬细胞的浸润则显著减少。基因表达分析显示，Tagln^-/-CAFs中与M2巨噬细胞招募相关的细胞因子Ccl11和Cxcl12的表达显著降低。这些结果表明，Tagln阳性CAFs通过促进胶原沉积和塑造免疫抑制微环境（减少T细胞浸润，增加M2巨噬细胞）来驱动PDAC的进展。

Diversity of myCAFs in human PDAC tissues

最后，研究者将目光转向人类PDAC。他们对人类PDAC组织样本进行了免疫荧光染色，发现与小鼠模型类似，CAFs中ACTA2和TAGLN的表达也存在异质性：包括双阳性、仅ACTA2阳性和仅TAGLN阳性的细胞。对19例人类PDAC样本的分析显示，在晚期（III期）肿瘤中，ACTA2和TAGLN双阳性CAFs的区域比早期（I/II期）肿瘤更大。对癌症基因组图谱（TCGA）数据库的分析表明，与正常组织相比，PDAC组织中ACTA2和TAGLN的mRNA表达水平显著升高，且两者表达高度正相关（r=0.9554）。更重要的是，TAGLN高表达与PDAC患者的总生存期缩短显著相关。

综上所述，这项研究通过整合多组学单细胞分析、基因功能缺失模型和临床相关性分析，系统地揭示了胰腺癌中肌成纤维样癌相关成纤维细胞（myCAF）的异质性，并首次明确地将转胶蛋白（TAGLN）鉴定为该群体中一个关键的促肿瘤功能驱动因子。研究结果表明，TAGLN不仅通过调节细胞骨架和细胞迁移直接促进肿瘤细胞的恶性行为，还通过增加胶原沉积和招募M2型巨噬细胞来塑造一个免疫抑制的肿瘤微环境，从而协同推动肿瘤进展。该研究的重要意义在于，它超越了将myCAF视为一个均质群体的传统观点，揭示了其内部的功能分工，并将TAGLN阳性myCAF亚群确立为PDAC中一个潜在的、有前景的基质靶向治疗靶点，为克服当前靶向αSMA阳性CAFs疗法的局限性提供了新的思路和实验依据。