CD44上调作为慢性肝病恶性转化的早期生物标志物：从纤维化到肝癌的分子桥梁及其预后价值

《British Journal of Cancer》：CD44 upregulation in chronic liver disease marks the transition to hepatocellular carcinoma and portends poor prognosis

本研究针对慢性肝病恶变缺乏早期预警标志物的临床难题，系统探讨了CD44及其剪接变体在肝细胞癌（HCC）发生发展中的作用。研究人员通过多种小鼠肝损伤模型和人类HCC队列分析，发现CD44（尤其是v6/v10变体）在慢性肝损伤中逐步上调并于HCC达到峰值，其高表达与患者不良预后显著相关。机制上，CD44high肿瘤富集IL-6/JAK/STAT3、TNF-α/NF-κB等致癌通路，并招募M2巨噬细胞、Th2细胞等免疫抑制群体，塑造促肿瘤微环境。该研究为肝癌早期诊断提供了新型生物标志物，并为靶向CD44的干预策略奠定了理论基础。

　　

在全球范围内，原发性肝癌是癌症相关死亡的第三大原因，其中肝细胞癌（HCC）占据了75%-85%的病例。绝大多数HCC发生在慢性肝病的背景之上，例如由乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感染、酒精性脂肪性肝炎（ASH）或代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MAFLD）等引起的肝纤维化和肝硬化。尽管有定期的影像学和生化指标监测，许多患者仍被诊断为晚期肝癌，这凸显了寻找能够早期预警恶性转化的分子标志物的紧迫性。

在这一背景下，CD44——一种广泛存在于细胞表面的跨膜糖蛋白，引起了研究人员的注意。它并非单一分子，而是通过可变外显子的选择性剪接形成多种异构体。CD44在细胞增殖、粘附、迁移以及免疫调节中扮演关键角色，并在多种癌症中被报道与肿瘤干细胞特性、侵袭转移和化疗耐药相关。然而，CD44及其不同变体在慢性肝病向HCC演变过程中的动态变化规律、临床意义及其在塑造肿瘤免疫微环境中的作用，尚缺乏系统性的阐述。为了解决这些问题，来自德国乌尔姆大学医院的研究团队在《British Journal of Cancer》上发表了一项深入研究。

为开展本研究，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在模型构建上，他们利用了六种小鼠模型，包括HBsAg、A1AT/HCV、CCl₄、Ikk2^ca诱导的慢性肝损伤模型，Rbpj条件性敲除的急性损伤模型，以及部分肝切除的再生模型，并分析了CCl₄处理的肝特异性Trp53敲除鼠的HCC肿瘤。在分析技术层面，研究采用了免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）检测CD44及其变体（如CD44v6）的蛋白表达与定位；通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测CD44各亚型（s, v3, v6, v7, v10）的mRNA水平。在生物信息学分析中，研究团队从TCGA、GEO等公共数据库获取了人类HCC的转录组和临床数据，利用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，通过GSVA、KEGG进行通路富集分析，并借助xCell算法和TISCH2数据库的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据深入解析了肿瘤免疫微环境的细胞组成。

CD44v6和v10标记肝细胞向恶性转化的承诺

研究发现，在正常和再生肝组织中CD44阳性细胞稀少，但在急慢性肝损伤模型的炎症区域则大量出现。这些细胞包括浸润的免疫细胞和一部分肝细胞。定量分析证实，与正常和再生肝相比，急慢性损伤肝组织中的CD44阳性染色显著增加。特别值得注意的是，CD44v6阳性细胞存在于所有慢性损伤模型中，并主要定位于炎症区域的肝细胞和胆管细胞。在CCl₄诱导损伤的时间进程中，随着纤维化的进展和免疫细胞聚集的增加，CD44阳性肝细胞的数量呈现阶段依赖性上升，在晚期纤维化和HCC组织中达到最高。在mRNA水平，CD44s以及变体CD44v6、CD44v7和CD44v10在鼠类HCC组织中被显著上调，其中CD44v6和CD44v10在慢性损伤肝脏中也明显增加。这些发现提示，CD44，尤其是v6和v10变体，在慢性肝损伤中被诱导，并在恶性阶段达到峰值，表明CD44阳性肝细胞与从纤维化到癌症的进程相关。

CD44高表达预示肝细胞癌的不良生存

对人类HCC数据的分析进一步验证了其临床意义。在TCGA数据集中，HCC肿瘤组织中的CD44 mRNA水平显著高于癌旁非肿瘤肝组织。在不同病因（HBV或HCV感染）的独立HCC队列（GSE62232, GSE14520）中也观察到一致的趋势，表明CD44上调是HCC的一个普遍特征。更重要的是，当根据CD44转录本水平将TCGA HCC患者分为CD44^high组和CD44^low组后，Kaplan-Meier生存分析显示，CD44^high组患者的总生存期显著更差（中位生存期约4.5年 vs. 约7.9年）。这一不良预后关联在整合了GTEx数据的GEPIA2分析中得到了证实。来自人类蛋白质图谱（HPA）的免疫组化结果也显示，CD44蛋白在HCC和肝内胆管癌（iCCA）组织中表达，而在正常肝和癌旁组织中几乎检测不到。

CD44高表达肿瘤呈现致癌特征和免疫抑制

为了探究CD44^high肿瘤预后更差的潜在原因，研究人员比较了其与CD44^low肿瘤的基因表达谱。他们发现CD44^high肿瘤中504个基因显著上调，223个基因下调。通路富集分析揭示，CD44^high肿瘤富集于多个致癌和炎症通路，包括细胞因子-细胞因子受体相互作用、cAMP信号通路、ECM-受体相互作用以及关键的癌症相关信号级联，如IL-6/JAK/STAT3、TNF-α/NF-κB和PI3K/AKT/mTOR。这些通路共同促进了肿瘤细胞的增殖、存活、转移和免疫逃逸。利用xCell进行的免疫细胞反卷积分析进一步表明，与CD44^low肿瘤相比，CD44^high肿瘤中含有显著更高比例的M2极化巨噬细胞和Th2细胞。由Th2细胞分泌的细胞因子（如IL-4, IL-13）可驱动巨噬细胞向促肿瘤的M2表型极化，而M2巨噬细胞又能分泌生长因子和细胞因子（如CCL2, CXCL8）促进肿瘤生长并抑制抗肿瘤免疫。

单细胞分析将CD44与恶性和免疫抑制细胞群体联系起来

单细胞RNA测序数据（来自TISCH2数据库）为上述发现提供了更精细的细胞分辨率。分析显示，在HCC和iCCA中，CD44不仅在高恶性上皮细胞中表达，也在肿瘤相关巨噬细胞、T细胞和单核细胞中高表达。值得注意的是，CD44高表达的HCC组织显示出免疫抑制细胞类型（如M2巨噬细胞和调节性T细胞（Tregs））的浸润富集。CD44表达水平也与HCC中巨噬细胞、Tregs和Th2细胞的标志物呈正相关。这些数据共同表明，HCC中CD44的过表达与一个以富含免疫抑制性浸润为特征的促肿瘤免疫微环境相关。

研究人员进一步通过免疫荧光共染色在小鼠模型中进行体内验证。发现与野生型、急性损伤和再生模型相比，慢性肝损伤模型中CD44阳性细胞显著增加，且主要位于免疫细胞聚集区内。在这些区域，不仅观察到了CD44阳性的肝细胞，还发现了大量CD44与F4/80（巨噬细胞标志）双阳性细胞，其中许多是募集的单核细胞。更重要的是，慢性肝损伤模型中M2型巨噬细胞（CD44+CD206+）和调节性T细胞（CD44+Foxp3+）显著增多，且主要分布于免疫聚集灶周围。这些体内实验结果表明，在慢性肝损伤过程中，CD44的表达与免疫抑制性免疫细胞亚群的募集和维持密切相关，这与人类HCC中的观察相一致。

结论与讨论

本研究通过整合小鼠模型和人类队列数据，系统性地论证了CD44在慢性肝病向HCC演进过程中的核心作用。研究结论可归纳为以下几点：首先，CD44及其特定剪接变体（如v6, v10）在慢性肝损伤中逐步上调，并于HCC阶段达到峰值，其表达水平与纤维化严重程度正相关，标志着肝细胞向恶性转化的承诺。其次，在人类HCC中，CD44的高表达是一个独立的预后不良指标，与患者较短的总生存期显著相关。第三，CD44^high的HCC肿瘤表现出独特的分子特征，包括多种致癌信号通路（如IL-6/JAK/STAT3, NF-κB）的激活，以及免疫微环境向免疫抑制状态的重塑，其特征是M2巨噬细胞、Th2细胞等免疫抑制群体的富集。单细胞分辨率的分析证实CD44在恶性细胞和免疫细胞中均有表达，共同塑造了促肿瘤微环境。

这项研究的发现具有重要的临床意义。CD44有望成为慢性肝病患者发生恶性转化的早期预警生物标志物。例如，在肝硬化患者的活检组织中检测到肝细胞CD44上调，可能提示其具有更高的HCC进展风险，从而需要加强监测。循环中可溶性CD44变体的水平也可能有助于识别处于恶变过程中的患者。同时，肿瘤组织CD44的高表达可作为预后分层指标，指导术后辅助治疗决策。更重要的是，CD44本身成为一个有潜力的治疗靶点。针对CD44的单克隆抗体、靶向药物递送系统或破坏其与配体（如透明质酸、骨桥蛋白（SPP1））相互作用的策略，可能通过逆转免疫抑制微环境或直接抑制肿瘤干细胞，为HCC的治疗提供新途径，特别是与现有免疫检查点抑制剂联合应用时。

总之，该研究确立了CD44及其异构体在慢性肝病-HCC演变序列中的关键地位，不仅为其作为早期诊断和预后判断的生物标志物提供了坚实证据，也揭示了其作为未来治疗干预靶点的巨大潜力，为改善肝癌这一高致死性疾病的临床管理带来了新的希望。