MKK4与MKK7调控青光眼相关损伤后视网膜神经节细胞胞体与轴突退行性变的关键机制

《Cell Death Discovery》：MKK4 and MKK7 control degeneration of retinal ganglion cell somas and axons after glaucoma-relevant injury

本研究针对青光眼病理中视网膜神经节细胞（RGC）退行性死亡机制不清的问题，通过构建DBA/2J慢性高眼压模型和C57BL/6J视神经挤压（CONC）模型，系统探讨了转录因子JUN/DDIT3及其上游激酶MKK4/MKK7在RGC胞体与轴突退行性变中的作用。研究发现MKK4/7缺失可同时保护RGC胞体存活和轴突完整性，并维持模式视网膜电图（PERG）振幅和胞体大小，而DDIT3/JUN缺失仅保护胞体存活却不改善轴突退变和功能衰退。这表明MKK4/7是启动青光眼相关损伤后RGC全细胞退行性变的关键上游枢纽，为开发神经保护疗法提供了新靶点。

　　

当我们谈论青光眼——这种全球致盲率排名第二的神经退行性疾病时，视网膜神经节细胞（RGC）的进行性死亡是其核心病理环节。尽管高眼压是主要风险因素，但RGC的轴突在视神经头处损伤后，其胞体与轴突如何走向毁灭的分子通路至今迷雾重重。更令人困惑的是，越来越多的证据表明，支配RGC胞体死亡和轴突退行性变的信号通路可能分属不同“指挥部”——例如，促凋亡蛋白BAX是胞体死亡的“执行官”，却对轴突的瓦勒氏退变无能为力；而Sarm1基因的缺失能延缓轴突退化，却救不了胞体的命。这种“胞体与轴突各自为政”的退化模式，使得寻找一个能同时调控两大 compartments 的“总开关”成为青光眼神经保护治疗的关键突破口。

近年来，转录因子JUN和DDIT3（亦称CHOP）被锁定为青光眼相关损伤后RGC胞体丢失的关键调控枢纽。然而，它们在退行性级联反应中的确切位置仍存争议：究竟是胞体中的JUN/DDIT3活动启动了轴突退变的信号，还是它们仅仅作为下游执行者，专司胞体凋亡而不插手轴突命运？为了解开这个谜团，研究团队将目光投向了JUN/DDIT3的上游激活者——MAP2K家族的MKK4和MKK7。这两种激酶不仅能通过JNK通路激活JUN，还能间接激活DDIT3，并且新近研究提示它们可能在轴突退变中扮演要角。那么，MKK4/7是否会是一个同时主宰RGC胞体与轴突命运的“更高层级指挥官”呢？为此，研究人员在《Cell Death Discovery》上发表了他们的最新发现。

研究者运用了多项关键技术：利用基因工程小鼠模型（包括DBA/2J慢性高眼压模型和C57BL/6J小鼠的受控视神经挤压CONC模型），通过全身性或细胞特异性（如Six3-cre、AAV2.2-CMV-Cre介导的视网膜神经元）基因敲除技术靶向Ddit3、Jun、Mkk4、Mkk7基因；采用组织学分析（视网膜铺片免疫荧光染色、视神经切片评分）评估RGC胞体存活（RBPMS标记）、轴突完整性、cCASP3凋亡信号及pJUN/pJNK激活；通过模式视网膜电图（PERG）和全视野视网膜电图（ERG）记录RGC功能；利用视神经复合动作电位（CAP）测量轴突生理功能；并持续监测小鼠眼压（IOP）以确保表型非眼压干扰所致。

DDIT3和JUN控制高眼压下的RGC胞体丢失而非轴突退变

在模拟人类青光眼慢性病程的DBA/2J小鼠模型中，联合敲除Ddit3和Jun（Ddit3/Jun-/-）并未改变其年龄相关性眼压升高模式，排除了眼压混杂因素。然而，在出现严重视神经损伤的12月龄小鼠中，Ddit3/Jun-/-却展现出强大的保护力：其视网膜内存活的RGC胞体数量比野生型D2小鼠提高了77%。

但令人意外的是，这种强有力的胞体保护并未惠及轴突——Ddit3/Jun-/-小鼠的视神经退行性变程度并未减轻，甚至略有加重。这表明，在高眼压环境下，DDIT3和JUN是胞体死亡的关键调节因子，但对轴突退行性变并无实质性贡献。

尽管胞体存活，Ddit3和Jun敲除未能阻止PERG振幅下降或胞体萎缩

既然胞体保住了，它们的“健康状况”又如何呢？研究团队通过纵向监测PERG振幅发现，尽管Ddit3/Jun-/-小鼠的RGC胞体大量存活，但其PERG振幅从9月龄起就出现显著下降，与野生型D2小鼠无异，至12月龄时振幅仅为5月龄时的25-30%。

同时，显微形态学分析显示，存活下来的RGC胞体出现了明显的萎缩，面积显著减小。这些功能与形态学的衰退并非源于光感受器或双极细胞的功能障碍（因为ERG a/b波下降轻微），且与视神经损伤的严重程度无关。这表明，导致胞体功能丧失和萎缩的机制，要么作用于DDIT3/JUN的上游，要么独立于DDIT3/JUN的激活。

MKK4和MKK7控制轴突损伤后RGC胞体和轴突的退行性变

那么，谁才是这个更上游的“总指挥”呢？研究者将目标锁定在MKK4和MKK7上。在C57BL/6J小鼠中，通过玻璃体腔注射AAV2.2-CMV-Cre特异性敲除RGC中的Mkk4和Mkk7（Mkk4/7-/-），有效阻断了CONC损伤后视神经头处JNK的激活和RGC胞体内JUN的磷酸化（减少91%），证明基因敲除效率显著。

结果令人振奋：Mkk4/7缺失在CONC后5天减少了85%的cCASP3阳性凋亡细胞，并在损伤后14天和2个月分别保留了90%的RGC胞体。

更重要的是，与Ddit3/Jun敲除形成鲜明对比的是，Mkk4/7缺失还显著保护了轴突——视神经的组织学结构完整性大为改善，其传导电信号的复合动作电位（CAP）振幅也得到良好保留。

MKK4/7缺失而非DDIT3/JUN缺失阻止了CONC后的功能衰退和胞体萎缩

最关键的区别体现在细胞功能与形态的维持上。在CONC模型中，Ddit3/Jun敲除虽然像Mkk4/7敲除一样防止了内丛状层（IPL）的变薄，但它无法阻止PERG振幅的急剧下降（下降约55%）和胞体的显著萎缩。而Mkk4/7敲除则表现完美：它不仅维持了IPL厚度，还几乎完全阻止了PERG振幅的下降和胞体大小的缩减。

这清晰地表明，MKK4/7调控的是一条超越DDIT3/JUN的、更为上游的信号通路，它同时掌管着RGC的存活（胞体）、健康（功能与形态）和轴突的完整性。

结论与意义

本研究清晰地揭示了青光眼相关损伤后RGC退行性变的两层调控网络：DDIT3和JUN作为下游关键枢纽，主要介导胞体的凋亡性死亡，但对轴突退变和胞体功能/形态的维持影响有限。而MKK4和MKK7则处于更上游的整合位置，它们不仅是DDIT3/JUN依赖性胞体死亡的重要激活者，更通过DDIT3/JUN非依赖性机制，驱动着轴突的瓦勒氏退变以及胞体功能的丧失和萎缩。因此，MKK4/7的激活很可能是启动RGC全细胞退行性变的“始动环节”。这一发现将此前认为相对独立的胞体与轴突退变通路在MKK4/7节点上联系了起来，为开发能够同时保护RGC胞体和轴突的广谱神经保护策略提供了极具潜力的新靶点。未来的研究需要进一步揭示MKK4/7在慢性高眼压模型中的作用，明确其上游激活因子（如DLK、LZK等MAP3Ks），并深入解析那些导致轴突退变和胞体功能衰退的DDIT3/JUN非依赖性下游效应器，从而为最终攻克青光眼神经退行性变奠定坚实的理论基础。