分子伴侣GRP94通过调控弗林蛋白酶影响TGF-β成熟的新机制及其在M2巨噬细胞和三阴性乳腺癌中的免疫调节作用

《Cell Death Discovery》：The chaperone GRP94 interacts with the proprotein convertase furin and regulates TGF-beta maturation in human primary M2 macrophages

本研究聚焦于内质网分子伴侣GRP94在TGF-β成熟通路中的新功能。研究人员通过多种实验技术证实GRP94与弗林蛋白酶（furin）直接相互作用，并发现抑制GRP94可显著降低furin酶活性和TGF-β分泌。该发现不仅揭示了GRP94在M2巨噬细胞和肿瘤细胞中调控TGF-β成熟的新机制，更为靶向GRP94的癌症免疫治疗提供了理论依据。

　　

在肿瘤微环境中，转化生长因子-β（TGF-β）作为一种关键的免疫抑制因子，通过调节免疫细胞功能促进肿瘤进展。其中，M2型巨噬细胞是TGF-β的重要来源，但其产生成熟TGF-β的分子机制尚未完全阐明。此前研究发现，内质网分子伴侣GRP94在调节性T细胞（Tregs）中通过伴侣蛋白功能调控TGF-β的激活，但在M2巨噬细胞中的作用仍属未知。

为了探究GRP94在M2巨噬细胞中是否参与TGF-β成熟过程，研究人员开展了一系列实验。他们发现GRP94特异性抑制剂PU-WS13处理人原代M2巨噬细胞后，不仅降低了前体TGF-β（pro-TGF-β）在细胞裂解物中的表达，还显著减少了活性TGF-β在培养上清中的分泌。这一效应并非由细胞毒性或转录水平变化引起，提示GRP94可能影响TGF-β的翻译后修饰过程。

进一步机制研究表明，GRP94与弗林蛋白酶（furin）存在直接相互作用。通过微量热泳动技术检测到重组GRP94与furin的结合解离常数K_d=186 nM，邻近连接实验和免疫共沉淀均在细胞水平验证了这一相互作用。更重要的是，GRP94抑制导致furin酶活性显著降低，同时影响其底物MMP14（基质金属蛋白酶14）的表达，而MMP14本身也参与TGF-β的最终激活步骤。

为验证这一机制的普适性，研究团队在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中进行了类似实验。使用两种不同结构的GRP94抑制剂（PU-WS13和GRP94 inhibitor-1）均能降低furin酶活性和活性TGF-β分泌。划痕实验显示GRP94抑制显著减弱了细胞迁移能力，这与TGF-β功能受损相一致。

此外，研究还发现GRP94与LRRC33（富含亮氨酸重复序列蛋白33，GARP在巨噬细胞中的旁系同源物）存在共定位和邻近关系。GRP94抑制剂处理减少了GRP94与LRRC33的相互作用，表明GRP94可能通过多个环节调控TGF-β成熟通路。

本研究采用的关键技术方法包括：从健康志愿者外周血单核细胞（PBMC）分化培养人原代M2巨噬细胞；通过微量热泳动技术分析蛋白质相互作用；使用荧光底物法检测弗林蛋白酶活性；采用邻近连接实验（PLA）和免疫共沉淀验证蛋白质相互作用；通过蛋白质印迹法分析目标蛋白表达；利用划痕实验评估细胞迁移能力。

GRP94抑制剂PU-WS13降低人原代M2巨噬细胞中成熟TGF-β的产生

研究人员发现，GRP94特异性抑制剂PU-WS13以剂量依赖方式显著降低M2巨噬细胞中前体TGF-β和活性TGF-β的表达，且这一效应与细胞毒性或转录水平变化无关。

GRP94抑制降低弗林蛋白酶活性和金属蛋白酶MMP14的表达

PU-WS13处理虽不影响furin蛋白表达，但显著降低其酶活性。同时，需要furin加工的MMP14表达也相应减少，表明GRP94抑制对furin底物具有广泛影响。

GRP94与人原代M2巨噬细胞中的弗林蛋白酶相互作用

通过微量热泳动、邻近连接实验和免疫共沉淀等多种技术，研究证实GRP94与furin存在直接相互作用，提示GRP94可能通过调节furin功能影响TGF-β成熟。

GRP94与弗林蛋白酶在人TNBC细胞系MDA-MB-231中的相互作用及其抑制对TGF-β成熟的影响

在肿瘤细胞中，GRP94同样与furin相互作用。两种GRP94抑制剂均能降低furin活性和TGF-β分泌，并抑制细胞迁移，表明该机制在不同细胞类型中具有保守性。

GRP94还与TGF-β成熟通路中的另一个蛋白LRRC33相关

GRP94与巨噬细胞特异性TGF-β锚定蛋白LRRC33存在共定位，且这种相互作用受GRP94抑制影响，提示GRP94可能通过多环节调控TGF-β成熟通路。

本研究首次揭示了GRP94通过直接相互作用调节furin酶活性的新机制，阐明了GRP94在M2巨噬细胞和肿瘤细胞中调控TGF-β成熟通路的关键作用。这些发现不仅深化了对免疫抑制微环境形成机制的理解，还为开发靶向GRP94的癌症治疗策略提供了重要理论依据。该研究发表于《Cell Death Discovery》期刊，为肿瘤免疫治疗领域提供了新的研究方向和治疗靶点。