生物素甲酯作为前体药物增强RUSH系统货物释放并实现TurboID快速生物素化

《Communications Biology》：Biotin methyl ester enhances cargo release in RUSH system and enables rapid biotinylation with TurboID

本研究针对生物素在活细胞中摄取缓慢导致RUSH系统货物释放不同步和TurboID生物素化效率低的问题，开发了生物素甲酯(BME)作为生物素前体药物。研究人员发现BME因其掩蔽的带电羧基而增强细胞穿透性，在RUSH系统中实现同步货物释放，并通过细胞内快速水解为生物素，显著提高TurboID介导的邻近生物素化效率。该研究为细胞生物学研究提供了重要工具，并对多种维生素反应性遗传代谢病患者具有潜在治疗意义。

　　

在细胞生物学研究领域，生物素-链霉亲和素技术一直是不可或缺的重要工具。这种技术利用生物素与链霉亲和素之间极高的亲和力，开发出了多种应用方法，其中包括能够同步释放细胞器内货物的RUSH系统，以及能够标记邻近蛋白质的TurboID邻近生物素化技术。然而，这些强大工具在实际应用中却面临着一个共同挑战——生物素在活细胞中的摄取效率问题。

生物素作为一种必需维生素，不仅是多种羧化酶的辅酶，参与关键代谢反应，更因其与链霉亲和素的强大结合能力而成为生物技术领域的明星分子。然而，生物素在生理pH条件下带有负电荷，导致其通过被动扩散穿过细胞膜的能力十分有限。细胞对生物素的摄取主要依赖于钠依赖性多种维生素转运蛋白(SMVT)，但这种主动运输过程的速度往往无法满足实验需求。

这一问题在RUSH系统中表现得尤为明显。RUSH系统通过链霉亲和素将SBP标记的货物蛋白滞留于特定细胞器，加入生物素后通过竞争性结合触发货物同步释放。但研究人员发现，不同细胞对生物素的响应存在显著差异，特别是在高表达货物和钩状蛋白的HeLa细胞中，从内质网到高尔基体的货物运输启动时间差异很大。类似地，在TurboID邻近生物素化实验中，生物素的缓慢摄取也限制了标记效率，难以捕捉快速的细胞动态过程。

面对这些挑战，来自广岛大学和理化学研究所的研究团队提出了一种创新解决方案——使用生物素甲酯(BME)作为生物素的前体药物。他们推测，通过将生物素的羧基酯化，可以掩蔽其负电荷，增强细胞膜穿透性，从而更快地递送生物素至细胞内靶点。

研究人员通过有机合成方法制备了BME，并系统评估了其在RUSH系统和TurboID生物素化中的应用效果。在方法学上，他们主要采用了活细胞成像技术观察RUSH系统中货物运输的动态过程，通过免疫印迹和共聚焦显微镜检测TurboID介导的生物素化效率，并利用qPCR分析了相关基因在不同细胞系中的表达差异。此外，还通过体外实验验证了BME的水解机制。

研究结果显示，BME在RUSH系统中表现出显著优势。与普通生物素相比，BME能够在极低浓度下实现所有细胞的同步响应，大大提高了实验的可重复性和时间分辨率。即使在表达高水平货物和钩状蛋白的细胞中，BME也能在20分钟内诱导货物在高尔基体区域的同步积累。

进一步机制研究表明，BME的细胞摄取不依赖于SMVT转运蛋白，即使在SMVT抑制剂泛酸存在下，BME仍能有效进入细胞并触发货物释放。这一发现证实了BME通过被动扩散穿透细胞膜的能力。

在TurboID生物素化实验中，BME同样展现出卓越性能。研究人员发现，BME处理组的生物素化信号强度在短时间内显著高于普通生物素组，特别是在处理初期的1-10分钟内，差异最为明显。通过免疫印迹定量分析，BME组的自生物素化和非自生物素化水平均比生物素组高出数倍。

值得注意的是，体外实验证实BME本身并不能直接作为TurboID的底物，其在细胞内的生物素化活性完全依赖于羧酸酯酶介导的水解作用。研究人员通过检测CES1和CES2在不同细胞系中的表达，发现BME的水解效率与羧酸酯酶活性密切相关。

时间进程实验进一步证实了BME在快速生物素化中的优势。即使在处理1分钟后，BME组的生物素化信号就已显著高于生物素组，这种优势在处理5-10分钟时达到峰值。这种快速响应特性使BME特别适合用于研究快速细胞过程。

研究人员还探讨了BME对不同细胞区室中TurboID活性的影响。通过构建定位于细胞质(ARF1::TurboID::Cv)和细胞核(H2B::TurboID::Cv)的TurboID变体，他们发现BME同样能够显著增强这些区室中的生物素化效率。这表明BME水解产生的生物素能够快速扩散至细胞内各个区域，为不同定位的TurboID提供充足底物。

研究结论部分，作者强调了BME作为生物素前体药物的双重价值。在技术应用层面，BME显著提升了RUSH系统的时间控制精度和TurboID的生物素化效率，为细胞生物学研究提供了更强大的工具。特别是在需要高时间分辨率的实验中，BME能够确保所有细胞同步响应，使研究人员能够精确追踪快速细胞过程。

在医学应用层面，BME的SMVT非依赖性摄取机制为治疗SMVT突变引起的多种维生素反应性遗传代谢病提供了新思路。这类患者由于SMVT功能缺陷，无法有效吸收生物素、泛酸和硫辛酸等多种维生素，而BME的跨膜扩散特性可能绕过这一限制，为患者提供有效的生物素补充方案。

该研究的创新性在于将前体药物策略成功应用于生物技术工具优化，不仅解决了实际实验中的技术瓶颈，还拓展了生物素-链霉亲和素技术的应用边界。通过简单的化学修饰，研究人员显著提升了现有方法的性能，这一思路可能为其他生物技术工具的优化提供借鉴。

总的来说，这项由Taisei Uehara、Arata Takiguchi等研究人员完成的工作，展示了基础化学修饰如何显著增强现有生物学工具的效能。他们开发的BME应用方案不仅立即可用于提升现有实验的效率和可靠性，还为理解细胞摄取机制和治疗相关疾病提供了新的视角。该研究发表于《Communications Biology》期刊，为细胞生物学和生物技术领域做出了重要贡献。