Wnt/FGF20信号轴通过调控FGFR4抑制增殖并促进近端芽基细胞迁移以驱动多疣壁虎尾部再生

《Communications Biology》：Wnt/FGF20 signaling axis promotes migration of proximal blastema cell during tail regeneration of Gekko japonicus

本研究针对再生过程中远端芽基细胞增殖低下但作为组织中心调控再生的机制不明问题，揭示了在多疣壁虎尾部再生模型中，Wnt/β-catenin信号在远端芽基细胞激活，通过下调FGFR4抑制细胞增殖，同时上调FGF20表达促进近端细胞迁移，阐明了Wnt/FGF20信号轴在建立再生组织中心中的关键作用，为理解陆生羊膜动物再生机制提供了新见解。

　　

自然界中，一些生物拥有令人惊叹的再生能力，能够重新长出失去的肢体或尾巴。例如，蝾螈可以再生四肢，斑马鱼可以再生鱼鳍，而壁虎则以其尾部再生能力著称。然而，哺乳动物（包括人类）的再生能力却极为有限。理解这些高再生能力动物的再生机制，对于开发促进人类组织修复和再生的策略具有重要意义。在附肢再生过程中，一个关键事件是芽基的形成——一群快速增殖的细胞在伤口处聚集，最终分化成新的组织。长期以来，科学家们观察到，在再生结构的远端区域，存在一群增殖活性较低的细胞，这些细胞被认为可能作为“组织中心”协调再生过程，但其具体调控机制尚不明确。

近日发表在《Communications Biology》上的一项研究，由南通大学刘艳和刘梅团队领衔，深入探究了多疣壁虎（Gekko japonicus）尾部再生过程中，Wnt/FGF20信号轴如何调控远端芽基细胞的行为，从而促进再生。研究发现，Wnt/β-catenin（β-连环蛋白）信号在远端低增殖的芽基细胞中被激活，这些细胞通过下调FGFR4（成纤维细胞生长因子受体4）的表达来抑制自身增殖，同时分泌FGF20（成纤维细胞生长因子20）来促进近端芽基细胞的迁移。这一发现揭示了再生过程中表皮与间充质细胞之间精确的相互对话，为理解再生“组织中心”的运作机制提供了新视角。

研究团队运用了多种关键技术方法。实验以多疣壁虎为模型，通过人工诱导断尾启动再生过程。研究采用了EdU（5-乙炔基-2’-脱氧尿苷）标记法检测体内外细胞增殖，免疫荧光染色观察β-catenin、FGF20和FGFR4的蛋白表达与定位，RNA测序（RNA-seq）和实时定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达变化。利用细胞共培养体系和Transwell（ Transwell小室）迁移实验评估细胞间相互作用，并通过荧光素酶报告基因实验验证了β-catenin对FGF20转录的直接调控。此外，还使用了Wnt信号激动剂（SKL2001）、抑制剂（IWP-4）和FGFR4特异性抑制剂（BLU9931）进行药理学干预，并通过siRNA（小干扰RNA）和质粒过表达进行基因功能操作。

Wnt/β-catenin信号在尾部再生远端低增殖芽基中激活

研究人员首先通过EdU标记发现，在再生第8、10、12和14天，距离伤口上皮（WE）最近的远端50微米区域（z1区）的芽基细胞中，EdU阴性（即非增殖）细胞的比例显著高于近端区域（z2-z5区），并且这一比例随着再生进程逐渐升高。进一步通过免疫荧光染色检测β-catenin的亚细胞定位发现，在再生第10、12和14天，这些EdU阴性的远端芽基细胞中，β-catenin发生核转位的比例显著高于EdU阳性的增殖细胞。这表明Wnt/β-catenin信号通路在低增殖的远端芽基细胞中被特异性激活，这与在斑马鱼鳍再生中的发现类似，提示其功能在再生过程中是保守的。

Wnt/β-catenin信号激活通过下调FGFR4表达抑制培养的芽基细胞增殖

为了探究Wnt信号如何影响细胞增殖，研究者在体外培养壁虎芽基细胞，并利用Wnt激动剂SKL2001激活信号通路。EdU实验证实，SKL2001处理确实降低了培养芽基细胞的增殖比例。通过RNA-seq和qRT-PCR分析，发现Wnt信号激活后，fgfr4的mRNA水平显著下调。体内实验进一步验证，在再生第10天和12天，远端芽基中fgfr4的mRNA水平低于第8天，且免疫荧光显示FGFR4蛋白在远端z1区的表达低于近端z3和z4区，并与细胞增殖呈正相关。使用Wnt抑制剂IWP-4体内干预后，fgfr4的表达上调。更重要的是，使用FGFR4特异性抑制剂BLU9931处理或通过siRNA敲低fgfr4，均能显著延迟尾部再生进程并抑制伤口上皮和芽基细胞的增殖。而在体外实验中，过表达fgfr4能够缓解Wnt激动剂SKL2001对细胞增殖的抑制作用。这些结果综合表明，Wnt/β-catenin信号可能通过负向调控FGFR4的表达来抑制远端芽基细胞的增殖。

Wnt/β-catenin信号激活的芽基细胞促进未激活芽基细胞的迁移而不影响其增殖

接下来，研究团队构建了一个体外共培养体系，以探讨被Wnt信号激活的芽基细胞（模拟远端细胞）对周围正常芽基细胞（模拟近端细胞）的影响。实验结果表明，与Wnt激活细胞共培养，并未改变正常芽基细胞的增殖活性，但却显著促进了它们的迁移能力。这提示Wnt激活的远端芽基细胞可能通过分泌某种因子来引导近端细胞的移动。

Wnt/β-catenin信号激活诱导远端芽基细胞中FGF20的表达

为了寻找上述迁移促进因子，研究者对SKL2001处理的芽基细胞进行了RNA-seq分析，发现fgf20的表达被显著上调。生物信息学分析预测了fgf20基因启动子区存在TCF/LEF转录因子结合位点，荧光素酶报告基因实验证实β-catenin能够直接激活fgf20的转录。体内实验显示，FGF20蛋白特异性地表达于紧邻伤口上皮的远端芽基区，而不在伤口上皮内，且其mRNA水平在再生过程中（第8至14天）逐渐升高。抑制Wnt信号后，fgf20的表达显著降低。这些结果确认FGF20是Wnt/β-catenin信号通路的下游靶基因。

Wnt信号激活的芽基细胞通过FGF20促进邻近芽基细胞迁移

最后，为了证实FGF20是介导细胞迁移的关键因子，研究人员进行了功能验证。共培养实验表明，过表达fgf20的芽基细胞能够有效促进正常芽基细胞的迁移，但不影响其增殖。更重要的是，在Wnt激活的芽基细胞中敲低fgf20，则显著削弱了其对正常细胞迁移的促进作用。这直接证明了Wnt信号激活的细胞是通过分泌FGF20来驱动邻近芽基细胞迁移的。

综上所述，本研究揭示了多疣壁虎尾部再生中一个精细的调控模块。伤口上皮分泌的Wnt配体激活其下方远端芽基细胞中的Wnt/β-catenin信号。这些被激活的细胞一方面通过下调FGFR4来降低自身的增殖活性，维持其作为相对静止的“组织中心”的特性；另一方面则上调FGF20的表达并分泌该因子，以旁分泌的方式吸引和促进近端增殖活跃的芽基细胞向远端迁移，从而协调整个再生过程的空间组织。这项工作不仅阐明了Wnt/FGF20信号轴在陆生羊膜动物再生中的保守且关键的作用，揭示了再生“组织中心”细胞行为调控的新机制，更重要的是强调了表皮与间充质组织之间双向通讯对于成功实现附肢再生的极端重要性。该模型为研究更复杂生物系统中的组织修复和再生提供了有价值的框架，其揭示的信号通路相互作用可能为探索促进哺乳动物有限再生能力的策略提供新的思路和靶点。