转氨酶催化全氟亚甲基顺序加氢脱氟：一种新型PFAS生物降解策略

《Communications Chemistry》：Transaminase-catalyzed sequential hydrodefluorinations of perfluorinated methylene groups

本研究针对全氟和多氟烷基物质(PFAS)中顽固的-CF2-基团难以被生物降解的难题，开发了工程化转氨酶(TA)催化的顺序加氢脱氟(HDF)系统。研究人员通过FRISM蛋白工程策略获得M122W-G224A突变体，实现对二氟化稠环酮类化合物的高效脱氟，19F NMR证实反应通过可逆转氨启动，最终实现>90%脱氟效率，为PFAS的生物降解提供了新思路。

　　

在当代工业社会中，含氟化学品因其独特的物理化学性质被广泛应用于各行各业，从防水涂料到医疗设备，处处可见其身影。然而，这些给人类生活带来便利的物质，却成为环境可持续性发展的"双刃剑"。全氟和多氟烷基物质(PFAS)因其高度的化学稳定性，在自然环境中难以降解，表现出显著的生物累积性和潜在生态毒性，被公认为工业化学污染的典型代表。究其根源，碳-氟(C-F)键的高强度（键解离能高达130 kcal·mol^--1）是导致这类物质难以被降解的主要原因。

传统上，生物降解因其成本效益和环境友好性而被视为降解氟化学品的理想方法。然而，自然界中存在的酶类能够降解大多数由天然产物中存在的官能团组成的人造化化合物，但对全氟亚甲基(-CF₂-）基团却束手无策，因为该基团在自然界中本不存在。尽管已有一些酶如氟乙酸脱卤酶(FAcD)能够降解二氟乙酸，氮酶能够降解"应变"二氟化环丙烯，但二氟亚甲基的酶活化仍然是一个具有挑战性的目标。

在这项发表于《Communications Chemistry》的研究中，由陈晓阳和楚肖鹤领导的研究团队开发了一种全新的生物降解平台，利用工程化转氨酶(TA)成功实现了对二氟化稠环酮类化合物的顺序加氢脱氟(HDF)。该研究不仅突破了酶催化降解全氟化合物的技术瓶颈，更为PFAS的环境治理提供了创新性解决方案。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过聚焦理性迭代位点特异性突变(FRISM)策略对转氨酶进行蛋白工程改造；利用¹⁹F NMR实时监测反应进程和中间体变化；以2,2-二氟-3,4-二氢萘-1(2H)-酮(1a)为模型底物进行反应条件优化；通过手性HPLC分析产物的对映选择性。

蛋白工程提升脱氟效率

研究团队以ATA117 Rd11（一种来自节杆菌属Arthrobacter sp.的工程化变体）为起点，通过理性设计构建了系列突变体。基于ATA117 Rd11的晶体结构分析(PDB: 5FR928)，研究人员确定了活性位点区域的关键突变热点，这些位点因其空间取向和与底物的潜在相互作用而被预测为催化活性的主要决定因素。G224A变体(M3)表现出最高的脱氟效率，转化率达到76%，产物2a收率为57%。而M122W-G224A双突变体(M5)在使用2.5当量2-PrNH₂作为胺供体时，实现了底物的完全脱氟，其周转数(TON)相较于野生型提高了7倍(504 vs 72)。

底物适用范围研究

研究人员系统评估了TA催化HDF反应的底物适用范围。结果表明，TA/2-PrNH₂方法可作为降解二氟化稠环酮的多功能平台，大多数情况下脱氟率超过90%。化学选择性HDF适用于各种二氟化四氢萘酮衍生物(1a-1k)，无论芳环上带有给电子还是吸电子取代基，主要生成相应的完全脱氟产物。该系统还兼容4-取代(1m)和4-氧杂(1n)底物，以及二氟化1-茚满酮(1o)，但后者主要生成单氟化酮产物。基于底物结构分析，空间位阻被认为是控制其生物降解活性的主要因素。

反应机理探究

令人惊讶的是，模型反应没有生成预期的胺化化合物，而是产生了1-四氢萘酮(2a)作为唯一可检测产物。为了探索这一新型酶促反应的机理，研究人员利用¹⁹F NMR作为有力工具，通过监测化学位移来追踪反应进程。在反应初始阶段检测到对应于4a的氟信号，为反应通过转氨启动提供了明确证据。反应3小时后，4a信号消失，同时出现了归属于3a的明显信号。6小时后，¹⁹F NMR谱中仅能检测到F^-。使用rac-4a作为底物进行实验时，该转化表现为高度对映选择性的动力学拆分过程，剩余43%(+)-4a具有优异的对映纯度(>99% ee)。

反应机制解析

研究提出了详细的反应机制：辅酶PLP在2-PrNH₂存在下转化为吡哆胺-5'-磷酸(PMP)，PMP与酮1a发生缩合反应形成外部醛亚胺I，然后通过互变异构共振经由醌型中间体产生关键的外部醛亚胺II。赖氨酸优先对亚胺键进行亲核加成，从而释放PLP并生成转氨反应产物4a。在替代反应路径中，不可逆的消除过程发生在加成步骤之前。外部醛亚胺II的热力学消耗驱动其前体4a的可逆转化，产生的烯胺在水中快速互变异构，生成相应的酮3a。单氟化中间体3a在生物催化系统中表现出显著增强的反应性，促使其有效参与后续催化循环，最终形成完全脱氟产物2a。

研究结论与意义

该研究成功开发了由PLP依赖性酶介导的二氟化酮连续HDF的多功能生物降解平台。通过半理性蛋白工程策略，获得了脱氟效率提高的突变酶。¹⁹F NMR反应进程监测揭示，这一新型HDF反应由可逆转化过程启动。对该反应的深入机理理解为推进酶工程策略提供了宝贵见解，实现了氟化学品的高效降解，同时对环境可持续性做出了重要贡献。该工作不仅拓展了生物催化在环境修复中的应用边界，也为解决PFAS污染这一全球性环境问题提供了新的技术路径。