基于纳米孔测序的循环肺癌生物标志物RNA甲基化谱分析新方法

《Communications Medicine》：Nanopore based RNA methylation profiling of a circulating lung cancer biomarker

本刊推荐：为解决液体活检中RNA表观转录组信息利用不足的问题，研究人员开展了基于纳米孔直接RNA测序的核糖体RNA片段2'-O-甲基化（Nm）分析研究。通过开发特异性接头连接技术和人工智能分类模型，实现了对22 nt肺癌相关rRF（28S4014-4035）单分子甲基化状态的精准检测（准确率92%）。在43例临床样本验证中，发现肺癌患者GmCm甲基化模式显著升高（AUC=0.84），为肺癌早期诊断提供了新型表观转录组 biomarker。

　　

在癌症早期诊断领域，液体活检技术正迎来革命性突破。传统组织活检的侵入性操作往往给患者带来较大创伤，而基于血液样本的检测方法则展现出巨大潜力。当前液体活检主要聚焦于循环肿瘤DNA（ctDNA）的检测，但循环游离RNA（cfRNA）作为生物标志物的潜力尚未被充分挖掘。特别是在RNA分子中广泛存在的化学修饰，如同遗传密码的"特殊字体"，可能蕴藏着重要的疾病信号。然而，由于技术限制，这些RNA修饰信息的解读一直面临挑战。

德国海德堡Hummingbird Diagnostics GmbH的Marta Sanchez-Delgado、Maurice Frank等研究人员在《Communications Medicine》上发表的研究，开创性地将纳米孔直接RNA测序技术应用于肺癌生物标志物的甲基化分析。该研究针对一个22核苷酸长度的核糖体RNA片段（28S^4014-4035）——该片段此前已被证实与肺癌相关，但其甲基化状态尚未被探索。

研究团队设计了一种创新的靶向捕获策略，通过连接结构引导的接头，成功实现了对短至22 nt的RNA片段进行纳米孔测序。该方法利用Dumbbell Oligo（哑铃寡核苷酸）5'接头和特异性3'接头的单步连接，将目标小RNA嵌入到适合测序的较长分子中。特别值得关注的是，研究人员通过三代适配体设计优化，在3'接头中引入poly(A)序列和锁核酸（LNA）修饰，显著提高了测序覆盖度。

关键技术方法包括：基于纳米孔平台的直接RNA测序技术、针对22 nt rRNA片段的特异性接头连接策略、基于动态规划算法的RNA/DNA序列分段识别、ResNet架构的深度学习模型训练。临床样本来自斯洛伐克大学医院招募的43例疑似肺癌患者（55-80岁，吸烟史≥20包年），通过血浆cfRNA提取和靶向文库构建进行分析。

小RNA测序在牛津纳米孔平台上的实现

研究人员突破了纳米孔直接RNA测序（DRS）的技术瓶颈，将测序范围扩展至22 nt的核糖体RNA片段（rRF）。通过结构导向的接头连接方法，成功构建了适用于纳米孔测序的文库。该方法采用形成茎环结构的5'接头和靶点特异性双链纳米孔反转录接头，确保了高效的特异性连接。经过三代适配体设计优化，最终版本（Oligo AB v3）在保持稳定QC指标的同时，实现了目标区域的高深度覆盖。

AI分类模型用于小RNA甲基化状态和条形码解复用

研究团队训练了基于ResNet的一维深度学习模型，分别用于小RNA插入片段甲基化状态和3'接头条形码的分类。通过对四种不同Nm甲基化状态（GC、GmC、GCm、GmCm）的合成寡核苷酸进行测序，建立了包含24个DRS文库的真实数据集。模型在测试集上表现出色，甲基化状态分类准确率达92%，条形码分类准确率达95%。标准曲线实验进一步证实了该方法的定量能力（Pearson r=0.997）。

生物样本中小RNA修饰的检测

在HCC-827肺癌细胞系条件培养基中，研究人员验证了该方法在生物样本中的适用性。野生型细胞中观察到G7位点甲基化频率为60.4%，C19位点为84.6%。通过CRISPR/Cas9技术敲除指导甲基化的SNORD102和SNORD75基因后，相应位点的甲基化水平显著降低，证实了方法的生物学相关性。

临床样本中小RNA修饰的检测及癌症诊断应用

在43例临床样本中，肺癌患者表现出显著的28S^4014-4035GmCm甲基化模式增加（p=1.05e-03），同时GC、GmC和GCm甲基化模式相应减少。这种甲基化变化模式在早期（I期和II期）肺癌患者中同样存在，且在NSCLC（非小细胞肺癌）和SCLC（小细胞肺癌）中表现一致。逻辑回归模型显示，28S^4014-4035GmCm甲基化比例对肺癌诊断具有独立预测价值（AUC=0.84）。

研究结论表明，该方法首次实现了血液中小RNA的单分子甲基化分析，并发现了肺癌相关的特异性甲基化模式。与现有液体活检方法相比，该技术能够同时捕获序列信息和表观转录组修饰，为癌症早期诊断提供了新的维度。虽然当前方法在生物样本中的捕获效率仍有提升空间，但其与多组学液体活检平台的兼容性预示着广阔的临床应用前景。

该研究的创新之处在于将纳米孔测序的应用范围拓展至超小RNA片段，并成功实现了2'-O-甲基化的单分子检测。这不仅为肺癌早期诊断提供了新的生物标志物，也为探索其他RNA修饰在疾病中的作用提供了技术框架。随着RNA修饰感知基础识别算法的进一步发展，这种方法有望实现全小RNA转录组水平的无偏倚修饰分析，推动液体活检技术进入多组学时代。